Mtb (mycobacterium tuberculosis) kháng thuốc mic trên môi trường lỏng

Mục đích và nguyên lý

Mục đích      

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của Bedaquiline, và 11 thuốc lao bao gồm nhóm thuốc lao hàng 1 (Isoniazid, Rifampicin và Ethambutol), các thuốc nhóm Fluoroquinolones (Ofloxacin, Levofloxacin và Moxifloxacin), nhóm thuốc tiêm hàng 2 (Amikacin, Kanamycin, Capreomycin) và các thuốc chống lao nhóm 5 (Linezolid, Clofazimine) với Mycobacterium tuberculosis. trên môi trường lỏng

Nguyên lý

Huyền dịch vi khuẩn được cấy vào môi trường không thuốc và môi trường chứa thuốc kháng sinh theo các nồng độ khác nhau. Xác định môi trường có nồng độ thuốc kháng sinh thấp nhất mà vi khuẩn không mọc, đây chính là nồng độ ức chế tối thiếu (MIC) của thuốc với vi khuẩn.

Chuẩn bị

Người thực hiện:

Người thực hiện: Người thực hiện đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp 2A.

Tủ ấm

Tủ lạnh.

Tủ âm sâu.

Máy Vortex

Máy đo độ đục.

Nồi hấp tiệt trùng.

pipet tự động 200ul, 1000ul.

Pipet tự động đa kênh (2-200ul),

Pipet aid (Thiết bị hỗ trợ hút pipet)

Kính đảo ngược chi u ánh sáng.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

	STT		Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao		Đơn vị tính
	1		Bộ Kit chuẩn panel 96 giếng		đĩa
	2		phoenix ID Brorth		tubes
	3		Tubes nước muối + tween		tubes
	4		MacFaland số 1,		ống
	4		MacFaland số  0.25		ống
	4		MacFaland số  0.5		ống
	4		MacFaland số 4.0		ống
	6		Cồn 700		ml
	8		Presept 2,5		viên
	9		Microshiel		ml
	11		Dung dịch rửa dụng cụ thủy tinh		ml
	1		pipet đa kênh		cái
	2		Đầu côn 200 µl		cái
	2		Đầu côn 1000 µl		cái
	3		Pipette nhựa 20ml		cái
	4		Pipette nhựa 3ml		cái
	6		Tuýp th y tinh trung tính đáy tròn		cái
	7		Bi thủy tinh 3 mm		viên
	8		Tuýp lưu chủng		cái
	9		Hộp lưu chủng		cái
	10		Túi nilon loại 2 lit chịu nhiệt hấp		cái
	11		Túi rác vàng hủy vật liệu lây nhiễm		cái
	12		Thùng rác có nắp		cái
	13		Thùng vận chuyển vật liệu lây nhiễm		cái
	14		Gía đựng tuýp		cái
	15		Chổi rửa tuýp, dụng cụ		cái
	16		Chai th y tinh trung tính 1000ml		cái
	17		Khăn lau tay		cái
	18		Găng sạch		đôi
19		Găng  hộ lý		đôi
20		Quần áo bảo hộ		cái
21		Quần áo công tác		bộ
22		Bút chì đen HB		Cái
23		Bút dạ		Cái
24		Bút bi		cái
25		Sổ lưu kết quả xét nghiệm		trang

Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm 1 lần /năm từ PXN chuẩn quốc tế 35,000đ/XN)

Bệnh phẩm

Chủng M.tuberculosis thuần, tuổi chủng từ 21 ngày đến 28 ngày. 

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

Các bước tiến hành

Chuẩn bị đĩa môi trường

Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn.

Cấy huyền dịch vi khuẩn vào đĩa môi trường.

Diễn giải và báo cáo kết quả

Đọc kết quả Kháng sinh đồ ngày thứ 10. Nếu kết quả chưa rõ ràng, đọc kết luận   ngày thứ 14. 

Bước 1: Đặt đĩa môi trường lên kính đảo chiều. Đầu tiên kiểm tra giếng chứng dương, giếng chứng âm, (giếng chứng dương phải có vi khuẩn mọc, giếng chứng âm phải không có vi khuẩn mọc). Sau đó đọc kết quả ở các giếng kháng sinh từ trái qua phải, từ trên xuống dưới. Ghi nhận các giếng có vi khuẩn mọc và tích dấu X vào ô tương ứng trong bảng dưới: (Trong quá trình đọc, so sánh với giếng chứng dương và chứng âm). 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

BDQ 0.008

BDQ 0.015

BDQ 0.03

BDQ 0.06

BDQ 0.12

BDQ 0.25

BDQ 0.5

BDQ 1

BDQ 2

BDQ 4

RIF 0.06

RIF 0.12

B

RIF 0.25

RIF 0.5

RIF 1

RIF 2

RIF 4

INH 0.03

INH 0.06

INH 0.12

INH 0.25

INH 0.5

INH 1

INH 2

C

INH 4

INH 8

INH 16

OFL 0.12

OFL 0.25

OFL 0.5

OFL 1

OFL 2

OFL 4

OFL 8

LEVO 0.12

LEVO 0.25

D

LEVO 0.5

LEVO 1

LEVO 2

LEVO 4

MXF 0.06

MXF 0.12

MXF 0.25

MXF 0.5

MXF 1

MXF 2

MXF 4

KAN 0.12

E

KAN 0.25

KAN 0.5

KAN 1

KAN 2

KAN 4

KAN 8

KAN 16

AMI 0.12

AMI 0.25

AMI 0.5

AMI 1

AMI 2

F

AMI 4

AMI 8

AMI 16

CAP 0.12

CAP 0.25

CAP 0.5

CAP 1

CAP 2

CAP 4

CAP 8

CAP 16

LZD 0.12

G

LZD 0.25

LZD 0.5

LZD 1

LZD 2

LZD 4

LZD 8

CFZ 0.015

CFZ 0.03

CFZ 0.06

CFZ 0.12

CFZ 0.25

POS

H

CFZ 0.5

CFZ 1

CFZ 2

CFZ 4

EMB 0.25

EMB 0.5

EMB 1

EMB 2

EMB 4

EMB 8

EMB 16

NEG

Sơ đồ đọc kết quả kháng sinh đồ trên môi trường lỏng

 Bước 2: Kết luận kết quả MIC của mỗi loại kháng sinh vào file dưới. Ghi nhận kết quả MIC   nồng độ thấp nhất mà vi khuẩn không mọc được. Nếu ở nồng độ thấp nhất mà vi khuẩn không mọc thì ghi nhận kết quả MIC giá trị đó. Nếu   nồng độ cao nhất mà vi khuẩn vẫn còn mọc thì ghi nhận MIC > giá trị đó.

Chú ý: Ví dụ trong dãy nồng độ của Bedaquiline, vi khuẩn mọc ở các giếng có nồng độ kháng sinh 0.008, 0.015, 0.03ug/ml. Giếng 0.06ug/ml vi khuẩn không mọc. Nhưng giếng 0.12ug/ml vi khuẩn lại mọc. Và các giếng tiếp theo 0.25, 0.5, 1, 2ug/ml vi khuẩn không mọc. Hiện tượng này gọi là “bỏ giếng”   0.06ug/ml. Khi đó, ta ghi nhận giá trị MIC là 0.25ug/ml.

Sai sót và xử trí

Sai sót

Pha huyền dịch vi khuẩn loãng hoặc đặc

Bảo quản môi trường không đúng

Nhiễm chéo trong quá trình thao tác kỹ thuật.

Thực hành không an toàn.

Xử lý

Tuân theo nghiêm ngặt quy trình.