Vi sinh vật nhiễm khuẩn hô hấp real- time pcr đa tác nhân

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Xác định DNA/RNA đặc trưng của các vi sinh vật gây bệnh trong bệnh phẩm đường hô hấp của người. 

Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR. 

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học ho c sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Máy real-time PCR đa màu và hệ thống máy vi tính.

Bộ lưu điện

Máy ủ nhiệt

Máy ly tâm > 12000 gpm/phút

Máy ly tâm lạnh

Tủ lạnh 2⁰C -8⁰C

Tủ âm sâu (-20⁰ C) hoặc (-70⁰C) (nếu có)

Máy vortex

Tủ an toàn sinh học 

Micropipettes các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

	STT		Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao		Đơn vị
	1		Tăm bông vô trùng hoặc lọ đựng bệnh phẩm		Cái
	2		Găng không có bột tal ( DNase-RNase free)		Đôi
	3		Khay đựng bệnh phẩm		Cái
	4		Hộp vận chuyển bệnh phẩm		Cái
5		Sinh phẩm chẩn đoán		Test
6		Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng		Test
7		Hóa chất và vật tư tiêu hao cho tách acid nucleic		Test
8		Tube eppendorff 1,5 ml		Cái
9		Strip 8 tubes 0,1 ml		Cái
10		Nắp đậy strip 8 tubes		Cái
11		Đầu côn có phin lọc 1 ml		Cái
12		Đầu côn có phin lọc 200 µl		Cái
13		Đầu côn có phin lọc 30 µl		Cái
14		Đầu côn có phin lọc 10 µl		Cái
15		Giấy thấm không bụi		Cuộn
16		Giấy xét nghiệm		Tờ
17		Sổ lưu kết quả xét nghiệm		Tờ
18		Bút viết kính		Cái
19		Bút bi		Cái
20		Mũ		Cái
21		Khẩu trang		Cái
22		Găng tay xử lý dụng cụ		Đôi
23		Quần áo bảo hộ		Bộ
24		Dung dịch xà phòng rửa tay		ml
25		Cồn sát trùng tay nhanh		ml
26		Dung dịch khử trùng		ml
27		Khăn lau tay		Cái
28		Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*

Ghi chú: 

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Dịch mũi hầu, dịch ngoáy họng, dịch tỵ hầu, dịch hút phế quản, dịch rửa phế quản.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

Tiến hành kỹ thuật

Thu nhận và xử lí mẫu

Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết DNA/RNA (nếu cần)

Tách chiết dna/ rna 

Thực hiện phản ứng real-time pcr

Nhận định kết quả

Điều kiện của phản ứng

Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang cho chứng nội dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền (đường biểu diễn âm tính).

Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang chứng nội dương tính

Phân tích mẫu

Mẫu dương tính: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng tương ứng với màu của từng tác nhân và bắt đầu từ chu kỳ 42 trở về trước. Một mẫu có thể dương tính với 1 hoặc nhiều tác nhân.  

Mẫu nghi ngờ: Mẫu có đường biểu diễn dương tính và lớn hơn chu kỳ 42 → thực hiện lại xét nghiệm. Nếu kết quả vẫn lặp lại thì trả lời kết quả dương tính. Nếu kết quả khác với lần đầu thì yêu cầu lấy lại mẫu bệnh phẩm khác để kiểm tra lại.

Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính.

Những sai sót và xử trí

Sự cố:

Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

Nguyên nhân:

Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế. 

Khắc phục:

Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu.

Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.