Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Phát hiện và định lượng Parvo virus B19 trong huyết tương hoặc huyết thanh và dịch ối của người.
Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)
Trang thiết bị
Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
Máy tách chiết acid nucleic.
Bộ lưu điện.
Máy ủ nhiệt.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml
Máy ly tâm lạnh > 12000 gpm/phút
Tủ lạnh 20C -80C
Tủ âm sâu (-200 C) hoặc (-700C) (nếu có)
Máy vortex
Tủ an toàn sinh học
Micropipettes các thể tích từ 0,5 µl – 1000 µl.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
|
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
|||
|
|
1 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
|||
|
|
2 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Cái |
|||
|
|
3 |
Tube đựng bệnh phẩm 5 ml |
Cái |
|||
|
|
4 |
Cryotube (lưu mẫu dương tính) |
Cái |
|||
|
|
5 |
LightMix® Kit Parvovirus B19 |
Test |
|||
|
6 |
LightCycler® FastStart DNA Master HybProbe |
Test |
|
|||
|
7 |
LightCycler 8-Tube Strips |
Cái |
|
|||
|
8 |
Hóa chất và VTTH cho tách chiết trên MPLC |
Test |
|
|||
|
9 |
LightMix Color Compensation 530 / 690 |
Test |
|
|||
|
10 |
Hóa chất chạy đường chuẩn |
Test |
|
|||
|
11 |
Pipet nhựa |
Cái |
|
|||
|
12 |
Đầu Pipét có lọc 1000 ul |
Cái |
|
|||
|
13 |
Giấy thấm không bụi |
Cuộn |
|
|||
|
14 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
|
|||
|
15 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Quyển |
|
|||
|
21 |
Bút viết kính |
Cái |
|
|||
|
22 |
Bút bi |
Cái |
|
|||
|
23 |
Mũ giấy |
Cái |
|
|||
|
24 |
Khẩu trang |
Cái |
|
|||
|
25 |
Găng không có bột tal |
Đôi |
|
|||
|
26 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
|
|||
|
27 |
Quần áo |
Bộ |
|
|||
|
28 |
Dung dịch xà phòng rửa tay |
ml |
|
|||
|
29 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
|
|||
|
30 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
|
|||
|
31 |
Khăn lau tay |
Cái |
|
|||
|
32 |
Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)* |
|
|
|||
Ghi chú:
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Huyết thanh, huyết tương, và dịch ối.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).
Tiến hành kỹ thuật
LightMix® Kit Parvovirus B19 EC (Roche – VD hoặc tương đương)
Thu nhận và xử lí mẫu
Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết RNA nếu cần.
Tách chiết dna:
Tách chiết bằng tay hoặc máy tự động
Chạy bù màu và thẩm định file bù màu:
Theo hướng dẫn kit LightMix®Color Compensation HybProbe. Bù màu khuyến cáo chạy khi thay lô của kít ho c 6 tháng chạy bù màu 1 lần.
Thực hiện phản ứng real-time pcr
Bật máy LC480, bật máy tính và phần mềm LC480.
Pha hóa chất:
Pha hỗn hợp primer và probe cho B19 (PSR) và Chứng nội ECT (reaction control)
Chuẩn bị ECT
Chuẩn bị mẫu
Chuẩn bị NTC (chứng âm)
Chuẩn bị dãy ống mẫu chuẩn
Chuẩn bị trộn hỗn hợp phản ứng PCR
Chạy real-time PCR
Nhận định kết quả
Điều kiện của phản ứng
Giá trị định lượng chấp nhận được nếu cả 3 chứng: chứng âm, chứng dương và chứng nội có nghĩa. Các chứng có giá như sau:
Chứng âm: không phát hiện.
Chứng dương: nằm trong khoảng cho phép của nhà sản xuất (đặc hiệu với từng lô thuốc thử).
Chứng nội: với chứng âm và mẫu có nồng độ thấp (10-1000 copies) phải có tín hiệu lên ứng với Ct khoảng 27 đến 30.
Ngược lại:
Chứng âm: Nếu chứng âm không hợp lệ thì phải thực hiện lại xét nghiệm cả chứng và toàn bộ lô bệnh phẩm.
Chứng dương: Nếu chứng dương không hợp lệ thì phải làm lại xét nghiệm toàn bộ mẻ chạy.
Chứng nội: không có tín hiệu lên với chứng âm và mẫu có nồng độ thấp (10-1000copies) ứng với Ct khoảng 27 đến 30 thì phải chạy lại mẫu đó.
Phân tích mẫu
Bảng biện luận kết quả:
|
Mẫu Parvo B19 Kênh 640 |
Chứng nội Kênh 670 |
Chứng dương Kênh 640 |
Chứng âm NTC Kênh 640 |
Biện luận kết quả |
|
Không khuếch đại |
Có khuếch đại |
Khuếch đại |
Âm tính |
Âm tính (không phát hiện) |
|
Ct |
NA |
Khuếch đại |
Âm tính |
Dương tính cho B19 |
|
Không khuếch đại |
Không khuếch đại |
Khuếch đại |
NA |
PCR Failed, chạy lại |
|
NA |
NA |
Không khuếch đại |
NA |
PCR Failed, chạy lại |
|
NA |
NA |
NA |
Dương tính |
Nhiễm, Chạy lại |
Hệ số chuyển đổi
Định lượng virus (VL) được tính toán sử dụng công thức sau:
VL(copies/ml) = MV(giá trị đo được) x EVF x SF
Trong đó:
VL = giá trị định lượng
MV = giá trị đo được [số copy trên phản ứng]
EVF = hệ số thể tích tách chiết [thể tích tách chiết thu được/ thể tích PCR] SF = hệ số mẫu [1000 µl/thể tích tách chiết của mẫu bệnh phẩm] Ví dụ:
Lấy 200 µl mẫu bệnh phẩm đi tách chiết thì hệ số mẫu SF = 1000/200=5. Dùng 5 µl trong tổng thể tích thu hồi là 100 µl làm template mix PCR thì hệ số thể tích tách chiết = 100/5=20.
Kết quả hệ số chuyển đổi là:
VL (copies/ml) = MV (giá trị đo được copies/phản ứng 20 µl) x 5 x 20
VL (copies/ml) = MV(copies/phản ứng) x 100
Những sai sót và xử trí
Sự cố:
Có mẫu và chứng nội cũng đềuu âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
Nguyên nhân:
Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
Khắc phục:
Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu.
Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.
