Zika virus real- time pcr

ZIKA VIRUS REAL- TIME PCR

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Xác định RNA đặc trưng của Zika virus 

Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time RT – PCR một bước. 

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

Bộ lưu điện

Máy ủ nhiệt

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml

Máy ly tâm lạnh > 12000 gpm/phút

Tủ lạnh 2⁰C -8⁰C

Tủ âm sâu (-20⁰ C) hoặc (-70⁰C) (nếu có)

Máy vortex

Tủ an toàn sinh học 

Micropipettes và các thể tích từ 0,5 µl – 1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

	STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao		Đơn vị
	1	Bông		Kg
	2	Dây garô		Cái
	3	Cồn		ml
	4	Bơm kim tiêm		Cái
	5	Panh		Cái
	6	Tube hoặc lọ đựng bệnh phẩm		Cái
7		Găng không có bột tal ( DNase-RNase free)	Cái
8		Khay đựng bệnh phẩm	Cái
9		Hộp vận chuyển bệnh phẩm	Cái
10		Sinh phẩm chẩn đoán	Test
11		Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng	Test
12		Kit tách RNA	Test
13		ống Falcon 50ml	Cái
14		Ependoff 1,7ml	Tube
15		Ependoff 0,2ml	Tube
21		Đầu côn 10 µl có lọc	Cái
22		Đầu côn 30 µl	Cái
23		Đầu côn 200 µl có lọc	Cái
24		Đầu côn 1 ml có lọc	Cái
25		Water-DEPC Treated	ml
26		Giấy thấm không bụi	Cuộn
27		Giấy xét nghiệm	Tờ
28		Sổ lưu kết quả xét nghiệm	Tờ
29		Bút viết kính	Cái
30		Bút bi	Cái
31		Mũ	Cái
32		Khẩu trang	Cái
33		Găng tay	Đôi
34		Găng tay xử lý dụng cụ	Đôi
35		Quần áo bảo hộ	Bộ
36		Dung dịch xà phòng rửa tay	ml
37		Cồn sát trùng tay nhanh	ml
38		Dung dịch khử trùng	ml
39		Khăn lau tay	Cái
40		Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*

Ghi chú: 

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Máu toàn phần, huyết thanh, huyết tương, nước tiểu, mẫu mô và các dịch sinh học khác. Tốt nhất là huyết thanh và nước tiểu.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

Tiến hành kỹ thuật

Bộ sinh phẩm VIASURE Zika, Dengue and Chikungunia Real-time PCR

Detection Kit (VD hoặc tương đương)

Thu nhận và xử lí mẫu

Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết RNA nếu cần.

Tách chiết rna:

Tách chiết bằng tay hoặc tự động.

Hồi chỉnh chứng dương

Thực hiện phản ứng real-time pcr

Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Bóc lớp vỏ nhôm che phủ trên đĩa hoặc tube phản ứng.

Cho dung dịch hồi chỉnh vào mỗi giếng.

Cho chứng +, chứng – hoặc dịch RNA tách chiết vào từng giếng, đậy nắp, ly tâm nhẹ. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.

Bật máy real-time PCR. Bật máy tính khởi động chương trình real-time PCR trước khi chạy mẫu ít nhất 15 phút. 

Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.

Chọn màu Cy5 (Zika), FAM (Dengue), ROX (Chikungunya) cho mẫu, chứng dương và chứng âm và HEX (hoặc JOE/VIC) cho chứng nội.

Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động

Lưu file dữ liệu vào máy tính

Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

Nhận định kết quả

Điều kiện của phản ứng

Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu Cy5, FAM,  ROX tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền (đường biểu diễn âm tính).

Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu Cy5, FAM,  ROX âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính.

Phân tích mẫu

Mẫu dương tính: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng tương ứng với màu của từng tác nhân và bắt đầu từ chu kỳ 40 trở về trước. Mẫu dương tính với Zika virus khi đường biểu diễn tương ứng với màu Cy5 dương tính. Một mẫu có thể dương tính với 1 trong 3 tác nhân hoặc dương tính đồng thời cả 3 tác nhân.  

Mẫu nghi ngờ: Mẫu có đường biểu diễn dương tính và bắt đầu từ sau chu kỳ 40→ đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thực hiện lại xét nghiệm sau 1-3 tháng.

Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính.

Những sai sót và xử trí

Sự cố:

Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

Nguyên nhân:

Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế. 

Khắc phục:

Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu.

Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.