Dengue virus real-time rt-pcr

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Phát hiện RNA đặc trưng của virus Dengue trong huyết thanh hoặc huyết tương  người. 

Nguyên lý

Xác định sự có mặt của gen đặc trưng sử dụng các cặp mồi và probe cho virus Dengue bằng kỹ thuật Real-time RT- PCR

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp 2

Tủ thao tác PCR

Máy Real-time PCR và hệ thống máy vi tính

Bộ lưu điện

Máy ly tâm > 12000 gpm/phút

Máy ly tâm lạnh dùng cho tube 0,2 ml

Máy ủ nhiệt  

Máy vortex

Tủ lạnh 2⁰C – 8⁰C

Tủ âm sâu (-20⁰C hoặc -70⁰C)     

Micropipette 10 – 1000 μl.

Hóa chất, sinh phẩm và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

TT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị
1.	Bơm kim tiêm	Cái
2.	Panh	Cái
3.	Khay đựng bệnh phẩm	Cái
4.	Hộp vận chuyển bệnh phẩm	Hộp
5.	Tube đựng bệnh phẩm	Cái
6.	Găng không bột	Cái
7.	Master Mix	Test
8.	Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng và kiểm tra chất lượng	Test
9.	Kit tách RNA	Test
10.	Primer 1 và 2 *	ml
11.	Probe *	ml
12.	Ethanol BDH	ml
13.	Water-DEPC Treated	ml
14.	Sodium hypochlorite	ml
15.	RNase AWAY™ Decontamination Reagent	ml
16.	Ống Eppendorf 1,5 ml	Tube
17.	Ống Eppendorf 0,2 ml	Tube
18.	Đầu côn 10 µl có lọc	Cái
19.	Đầu côn 20 µl	Cái
20.	Đầu côn 200 µl có lọc	Cái
21.	Đầu côn 1 ml có lọc	Cái
22.	Bộ pipetman (5 chiếc)	Bộ
23.	Giấy thấm	Cuộn
24.	Giấy xét nghiệm	Tờ
25.	Sổ lưu kết quả xét nghiệm	Tờ
26.	Bút viết kính	Cái
27.	Bút bi	Cái
28.	Mũ	Cái
29.	Khẩu trang	Cái
30.	Găng tay	Đôi
31.	Găng tay xử lý dụng cụ	Đôi
32.	Quần áo bảo hộ	Bộ
33.	Dung dịch xà phòng rửa tay	ml
34.	Cồn sát trùng tay nhanh	ml
35.	Dung dịch khử trùng	ml
36.	Khăn lau tay	cái
37.	Ngoại kiểm (nếu có)**

** Ghi chú: 

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Huyết thanh, huyết tương hoặc máu toàn phần

Các bước tiến hành

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

Tiến hành kỹ thuật

Tách chiết rna tổng số 

Thực hiện real-time rt-pcr

Thực hiện bước này với các tube qPCR mix được giữ trong khay giữ lạnh hoặc trên đá vảy.

Chỉ lấy đủ số tube qPCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng qPCR  phải spin down nhanh tube qPCR để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube

Chuẩn bị các thành phần của phản ứng Real-time RT-PCR

Thêm 5 µl của mẫu RNA, chứng dương hoặc chứng âm vào từng tube qPCR đã gồm đầy đủ các thành phần.

Khởi động  máy  real-time  PCR. Khởi động máy tính và chương trình realtime PCR

Cài đặt vị trí mẫu trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy realtime PCR 

Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động. 

Nhận định kết quả

Đọc kết quả ở bước sóng 530 (kênh màu FAM)

Các trường hợp	Chu kỳ (Ct)	Nhận định kết quả
1	Không tín hiệu	Dưới giới hạn phát hiện ho c âm tính
2	Tín hiệu xuất hiện	Dương tính
3	Tín hiệu xuất hiện trong khoảng 3845 chu kỳ	Chạy lại, nếu vẫn 38-45c, kết quả là Dưới giới hạn phát hiện.

Những lưu ý và xử trí

Đọc kỹ hướng dẫn qui trình xét nghiệm trước khi thực hiện. 

Bảo quản bộ kit theo đúng hướng dẫn theo hướng dẫn của nhà sản xuất, riêng thành phần mẫu chứng dương nên giữ ở -80^o C cho bảo quản lâu dài.

Khu vực tách RNA, mix phản ứng qPCR phải được bố trí biệt lập và khử trùng bề mặt bằng dung dịch sodium hypochloride 0,5%, dụng cụ sau sử dụng phải rửa kỹ dưới vòi nước với xà phòng, sau đó lau lại bằng dung dịch RNase AWAY™ Decontamination Reagent; chiếu tia tử ngoại khi trước và sau khi thao tác để tránh nhiễm chéo.

Quá trình mix thực hiện trên đá vẩy hoặc PCR cooler, thực hiện chạy Realtime-PCR ngay sau khi mix xong phản ứng.

Trong trường hợp mẫu chứng dương và mẫu chứng âm xuất hiện không đúng với diễn giải ở phần IV thì phải kiểm tra lại Master mix, chứng dương và quá trình tách RNA tổng số, thực hiện lại toàn bộ xét nghiệm.