Leptospira định danh pcr

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Phát hiện sự có mặt đoạn gene đặc trưng của Leptospiracó trong bệnh phẩm. 

Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật PCR.          

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp 2

Máy ủ nhiệt

Máy ly tâm > 12000 gpm/phút

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml

Máy vortex

Máy chạy PCR

Các loại Micropipette đi u chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl

Máy điện di

Máy đọc ảnh gel     

Lò vi sóng

Tủ lạnh thường

Tủ âm sâu (20⁰C) hoặc (-70⁰C) (nếu có)

Bộ lưu điện

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

STT		Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao		Đơn vị
1		Dụng cụ lấy bệnh phẩm		Ống
	STT		Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao		Đơn vị
	2		Khay đựng bệnh phẩm		Cái
	3		Hộp vận chuyển bệnh phẩm		Cái
	4		Găng không có bột (DNase-RNase free)		Đôi
	5		Ống nhựa Eppendoff 1.5ml		ống
	6		Sinh phẩm chẩn đoán		Test
	7		Khấu hao sinh phẩm cho mẫu chứng các loại, kiểm tra chất lượng		Test
	8		Kit tách chiết DNA		Test
	9		Ống Eppendorf 1,5 ml		Tube
	10		Ống Eppendorf 0,2 ml		Tube
	11		Đầu côn 10 ul có lọc		Cái
	12		Đầu côn 30 ul		Cái
	13		Đầu côn 200 ul có lọc		Cái
	14		Đầu côn 1 ml có lọc		Cái
	15		Ethanol BDH		ml
	16		Water-DEPC Treated		ml
	17		Thạch		Gram
	18		Ladder		ml
	19		Blue Juice Gel loading dye		ml
	20		Ethidium Bromide (Redgel)		ml
	21		TAE Buffer		ml
	22		Giấy thấm		Cuộn
	23		Giấy xét nghiệm		Tờ
	24		Sổ lưu kết quả xét nghiệm		Tờ
	25		Bút viết kính		Cái
	26		Bút bi		Cái
	27		Mũ		Cái
	28		Khẩu trang		Cái
	29		Găng tay		Đôi
	30		Găng tay xử lý dụng cụ		Đôi
	31		Quần áo		Bộ
STT		Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao		Đơn vị
32		Dung dịch xà phòng rửa tay		ml
33		Cồn sát trùng tay nhanh		ml
34		Dung dịch khử trùng		ml
35		Khăn lau tay		cái
36		Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*

Ghi chú: 

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Huyết thanh ho c huyết tương

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ   trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục ).

Tiến hành kỹ thuật

Tách chiết DNA từ bệnh phẩm

Pha hỗn hợp phản ứng PCR

Chạy phản ứng PCR

Điện di sản phẩm PCR

Đọc kết quả

Nhận định kết quả

Phản ứng dương tính khi có sản phẩm PCR là một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét, không bị đứt gẫy và có kích thước tương ứng với đoạn gen đích cần khuếch đại.

Phản ứng âm tính nếu không có vạch sản phẩm PCR có kích thước tương ứng với đoạn gen đích cần khuếch đại.

Những sai sót và xử trí

Phản ứng dương tính giả: do tạp nhiễm từ môi trường

Phản ứng âm tính giả: do phản ứng PCR bị ức chế

Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân thủ chặt chẽ quy trình kỹ thuật.