Helicobacter pylori real-time pcr

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Phát hiện DNA đặc trưng của Helicobacter pyloritừ mảnh sinh thiết dạ dày.

Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật Real-time PCR.

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính

Bộ lưu điện

Tủ an toàn sinh học cấp 2 

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml

Máy ly tâm > 12000 gpm/phút

Máy ủ nhiệt

Máy vortex

Chày cối nghi n

Tủ lạnh 2^oC – 8^oC

Tủ âm sâu (-20^oC) hoặc (-70^oC)

Micropipettes các thể tích từ 5-1000µl

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

	STT		Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao		Đơn vị
	1		Dụng cụ lấy bệnh phẩm		Cái
	2		Găng không bột tal		cái
	3		Khay đựng bệnh phẩm		Cái
4		Hộp vận chuyển bệnh phẩm		Test
5		Sinh phẩm chẩn đoán		Test
6		Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng		Test
7		Kit tách chiết DNA		Test
8		Ống Falcon 50 ml		Cái
9		Eppendorf 1,7 ml		Tube
10		Eppendorf 0,2 ml		Tube
11		Đầu côn 10 µl có lọc		Cái
12		Đầu côn 30 µl		Cái
13		Đầu côn 200 µl có lọc		Cái
14		Đầu côn 1ml có lọc		Cái
15		Water-DEPC treated		ml
16		Giấy thấm		Cuộn
17		Giấy xét nghiệm		Tờ
18		Sổ lưu kết quả xét nghiệm		Tờ
19		Bút viết kính		Cái
20		Bút bi		Cái
21		M		Cái
22		Khẩu trang		Cái
23		Găng tay xử lý dụng cụ		Đôi
24		Quần áo bảo hộ		Bộ
25		Dung dịch xà phòng rửa tay		ml
26		Cồn sát trùng tay nhanh		ml
27		Dung dịch khử trùng		ml
28		Khăn lau tay		Cái
29		Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*

Ghi chú: 

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Mảnh sinh thiết dạ dày.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Lấy qua ống nội soi đường miệng

Quan sát thấy ổ loét, lấy 4 mẫu (3 mẫu ở các góc tổn thương loét, lấy ở vùng mép (ranh giới) của tổn thương và một mảnh ở trung tâm) hoặc lấy các vị trí có tổn thương nghi ngờ do H. pylori (trợt, niêm mạc sần,…)

Dùng kim lấy máu chuyển bệnh phẩm từ  kim sinh thiết vào lọ đựng bệnh phẩm.

Tiến hành kỹ thuật: 

Bộ sinh phẩm H. pylori Real-TM (Sacace –VD hoặc tương đương)

Thu nhận và xử lý mẫu

Tách chiết DNA

Thực hiện phản ứng real-time PCR

Nhận định kết quả

Điều kiện của phản ứng

Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE  dương tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính. 

Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM dương tính, đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE âm tính.

Phân tích mẫu

Mẫu dương tính: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng với màu bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trước. 

Mẫu nghi ngờ: Mẫu có đường biểu diễn dương tính và bắt đầu từ sau chu kỳ 36,đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm.

Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính.

In đồ thị kết quả

Những sai sót cần xử trí

Nếu đường đồ thị huỳnh quang của mẫu xuất hiện ở ngoài chu kỳ thứ 40 thì phải cẩn thận kiểm tra và đánh giá lại mẫu.