Neisseria gonorrhoreae kháng thuốc trình tự gen

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Phát hiện sự thay đổi trình tự nucleotide trên hệ gene của Neisseria gonorrhoreae có liên quan đến khả năng kháng thuốc. 

Nguyên lý

Dựa trên trình tự nucleotide đặc trưng của gene mã hóa cho đặc tính kháng thuốc của vi khuẩn bằng kỹ thuật giải trình tự gene.

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học)..

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp 2

Máy ủ nhiệt

Máy ly tâm 25000 x g

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml

Máy vortex –   Máy PCR 

Máy giải trình tự gene

Bộ lưu điện

Ống Eppendorf 1,5 ml ho c 2 ml

Các loại Micropipette điều chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl

Đầu côn có màng lọc 10 μl, 100 μl, 200 μl và 1000 μl

Tủ lạnh thường

Tủ âm sâu (20⁰C) ho c (-70⁰C) (nếu có)

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị
1	Giấy xét nghiệm	Tờ
2	Dụng cụ lấy bệnh phẩm	Que
3	Găng không có bột (DNase-RNase free)	Đôi
4	Sinh phẩm chẩn đoán	Test
5	Khấu hao sinh phẩm cho chẩn đoán và kiểm tra chất lượng	Test
6	Kit tách chiết DNA/RNA	Test
7	Ống Eppendorf 1,5 ml	Tube
8	Ống Eppendorf 0,2 ml	Tube
9	Đầu côn 10 ul có lọc	Cái
10	Đầu côn 30 ul	Cái
11	Đầu côn 200 ul có lọc	Cái
12	Đầu côn 1 ml có lọc	Cái
13	Ethanol BDH	Ml
14	Water-DEPC Treated	Ml
15	Thạch	Gram
16	Ladder	ml
17	Blue Juice Gel loading dye	ml
18	Ethidium Bromide (Redgel)	ml
19	TAE Buffer	ml
20	Giấy thấm	Cuộn
21	Giấy xét nghiệm	Tờ
22	Sổ lưu kết quả xét nghiệm	Tờ
23	Bút viết kính	Cái
24	Bút bi	Cái
25	Mũ	Cái
26	Khẩu trang	Cái
27	Găng tay xử lý dụng cụ	Đôi
28	Quần áo	Bộ
29	Dung dịch xà phòng rửa tay	ml
30	Cồn sát trùng tay nhanh	ml
31	Dung dịch khử trùng	ml
32	Khăn lau tay	cái
33	Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*

Ghi chú: 

 Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Dịch niệu đạo, cổ tử cung hoặc chủng vi khuẩn lậu.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem phụ lục).

Tiến hành kỹ thuật

Tách chiết DNA tổng số

Thực hiện PCR gene kháng thuốc

Điện di kiểm tra sản phẩm

Giải trình tự gene

Kiểm tra sự thay đổi nucleotide của gene kháng thuốc và kết luận

Nhận định kết quả

Sản phẩm PCR phải có một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét và không bị đứt gẫy. Trình tự DNA của gene đích được so sánh với các trình tự của gene của chủng hoang dại trên “Genebank” để xác định sự có mặt hoặc không có mặt của các đột biến kháng thuốc đã được biết.

Những sai sót và xử trí

Trong trường hợp không có sản phẩm PCR, cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết DNA tổng số, chất lượng primers và master mix, và thực hiện lại.

Nếu trình tự DNA bị nhiễu cần phải kiểm tra lại độ đặc hiệu của sản phẩm PCR hoặc quá trình chạy PCR sequencing bị nhiễm chéo.