Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Xét nghiệm hỗ trợ phát hiện nhiễm M. tuberculosis thông qua việc phát hiện interferon γ (IFN-γ) bằng kỹ thuật ELISA.
Nguyên lý
Phát hiện interferon γ do các tế bào miễn dịch tạo ra khi bị kích thích b i các mycobacterial peptides (ESAT-6, CFP-10 và TB7.7(p4)) dựa trên nguyên lý của kỹ thuật ELISA.
Chuẩn bị
Người thực hiện:
Người thực hiện: Người thực hiện đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành xét nghiệm.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành xét nghiệm.
Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)
Trang thiết bị
Tủ ấm thường
Dàn máy ELISA
Máy ly tâm thường
Máy lắc phiến nhựa
Máy Vortex
Máy đọc phiến nhựa bước sóng 450 nm và 620 – 650 nm
Tủ lạnh 20C – 80C
Micropipette đơn kênh thể tích từ 10 µl đến 1000 µl.
Bộ micropipette 8 kênh thể tích từ 50 µl đến 200 µl
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
|
1 |
Bông |
Kg |
|
2 |
Dây garô |
Cái |
|
3 |
Cồn |
mL |
|
4 |
Bơm kim tiêm |
Cái |
|
5 |
Panh |
Cái |
|
6 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
|
7 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Cái |
|
8 |
Tube đựng bệnh phẩm |
Cái |
|
9 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
|
10 |
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm chất lượng |
Test |
|
11 |
Chứng ngoại kiểm âm (nếu có) |
Ml |
|
12 |
Chứng ngoại kiểm dương (nếu có) |
Ml |
|
13 |
Ngoại kiểm (EQAS) (nếu có)* |
|
|
14 |
Nước cất |
Ml |
|
15 |
Đầu côn 1000 µl |
Cái |
|
16 |
Đầu côn 200 µl |
Cái |
|
17 |
Giấy thấm |
Cuộn |
|
18 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
|
19 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
|
20 |
Bút viết kính |
Cái |
|
21 |
Bút bi |
Cái |
|
22 |
Mũ |
Cái |
|
23 |
Khẩu trang |
Cái |
|
24 |
Găng tay |
Đôi |
|
25 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
|
26 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
|
27 |
Dung dịch xà phòng rửa tay |
Ml |
|
28 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
Ml |
|
29 |
Dung dịch khử trùng |
Ml |
|
30 |
Khăn lau tay |
Cái |
Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 4 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Máu toàn phần 4 ml lấy vào 4 ống, mỗi ống 1 ml theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.
Lấy bệnh phẩm
Lấy 1mL máu tĩnh mạch vào trong mỗi ống QFT (4 ống).
Sau khi lấy máu xong, lập tức lắc các ống khoảng 10 lần vừa đ mạnh để đảm bảo toàn bộ bề mặt bên trong của ống được phủ máu (để hòa tan) toàn bộ các kháng nguyên trên thành ống.
Chuyển các ống tới phòng xét nghiệm nhiệt độ 17 – 27°C.
Máu phải được ủ ấm nhiệt độ 37°C càng sớm càng tốt (và trong vòng 16 giờ sau khi lấy máu)
Tiến hành kỹ thuật
Bộ sinh phẩm QuantiFERON®-TB Gold (QFT®) plus (VD hoặc bộ sinh phẩm tương đương)
|
Các bước |
Nội dung |
|
2.1 |
Máu phải được ủ ấm càng sớm càng tốt (trong vòng 16 giờ sau khi lấy máu) Ủ ấm các ống vị trí đặt thẳng đứng 37°C trong 16 – 24 giờ. Không cần điều kiện độ ẩm/CO2. |
|
2.2 |
Ly tâm các tube 2000–3000g (RCF) trong thời gian 15 phút. |
|
2.3 |
Tách huyết tương Các mẫu Huyết tương nên chỉ được thu bằng pipette Các mẫu huyết tương có thể được lấy trực tiếp từ các ống QFT đã ly tâm vào các giếng ELISA, bao gồm cả khi sử dụng dàn ELISA tự động. Các mẫu huyết tương đã tách có thể được bảo quản trong 28 ngày nhiệt độ 2–8°C, dưới –20°C trong thời gian dài hơn. |
|
2.4 |
Đánh số, sắp xếp bệnh phẩm và viết sơ đồ theo thứ tự. |
|
2.5 |
Chuẩn bị hóa chất ELISA Hiệu chỉnh Lọ Standard và Conjugate |
|
2.6 |
Vẽ sơ đồ thực hiện |
|
2.7 |
Chuẩn bị dung dịch Standard và dung dịch Working Strength |
|
2.8 |
Chuẩn bị số Trip trên đĩa ELISA đ cho số lượng mẫu |
|
2.9 |
Lấy 50µL dung dịch working strength vao mỗi giếng ELISA Lấy 50µL huyết tương vào các giếng ELISA mẫu (trừ các giếng S1,S2,S3,S4) ghi sơ đồ |
|
2.10 |
Lắc đĩa trong thời gian 1 phút nhiệt độ phòng trong thời gian 2 giờ (Cần bọc đia ELISA để tránh tiếp xúc ánh sáng trực tiếp. |
|
2.11 |
Chuẩn bị dịch rửa |
|
2.12 |
Hút 100µL dung dịch Substrate vào mỗi giếng Phủ kín và ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 30 phút Cho tiếp 50µL dung dịch stopping solution vào mỗi giếng và lắc |
|
2.13 |
Đo OD ở bước sóng 450nm và tham chiếu bước sóng 620nm trong vòng 5 phút khi dừng phản ứng |
|
2.14 |
Sử dụng phần mềm QFT 2.7.1 để phân tích kết quả |
Nhận định kết quả
Xác nhận kết quả khi:
Giá trị trung bình OD cho Standard 1 phải ≥ 0,600 %CV của các giá trị lặp lại của Standard 1 và Standard 2 phải ≤ 15%
Các giá trị OD lặp lại của Standard 3 và Standard 4 phải không sai khác qua 0,040 đơn vị OD so với giá trị trung bình c a nó.
Hệ số tương quan tính từ các giá trị trung bình của các Standards phải ≥ 0,98.
Diễn giải kết quả
|
Nil (IU/mL )
(1) |
Hiệu số TB1 Ag-Nil (IU/mL) (2) |
Hiệu số TB2 AgNil (IU/mL) |
Hiệu số Mitogen -Nil (IU/mL) (3) |
Kết quả QuantiFERON Plus
|
Giải thích |
|
≤8.0 |
≥ 0.5 |
Âm tính |
K ết quả cho biết không nhiễm Lao |
||
|
≥ 0.35 & |
≥ 0.35 & |
≥ 0.5 |
|||
|
≥ 0.35 & ≥ 25% Nil |
Bất kỳ |
Bất kỳ |
Dương tính |
K ết quả cho biết tình trạng nhiễm Lao |
|
|
Bất kỳ |
≥ 0.35 & ≥ 25% Nil |
||||
|
Không xác định |
Kết quả không xác định cho biết không có phản ứng với kháng nguyên Lao |
||||
|
≥ 0.35 & |
≥ 0.35 & |
||||
|
>8 |
Bất kỳ |
Bất kỳ |
Bất kỳ |
Những sai sót và xử trí
Sai sót
Kết quả không xác định ho c không tin cậy có thể do:
Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn.
Mẫu từ lúc lấy đến lúc được 37ºC lâu hơn 16 tiếng.
Lượng interferon γ quá nhiều heterophile antibody.
Xử trí
Tuân thủ đúng các bước qui trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn và độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm sử dụng.
