Hpv genotype real-time pcr  

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Xác định genotype của Human Papillomavirrus (HPV) trong bệnh phẩm đường sinh dục.

Nguyên lý

Xác định genotype của HPV và dựa trên nguyên lý của kỹ thuật real-time PCR và reverse dot blot. 

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị

Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

Bộ lưu điện.

Máy ủ nhiệt.

Máy ly tâm dung cho tube 0,2 ml.

Máy ly tâm 25000 x g.

Tủ an toàn sinh học cấp 2.

Máy vortex.

Tủ lạnh 2ºC – 8ºC.

Tủ âm sâu (-20ºC) hoặc (-70ºC).

Micropipette các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu/lần.

STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị	Số lượng
1	Tăm bông vô trùng	Cái	1,000
2	Găng không có bột tal	Đôi	0,100
3	Khay đựng bệnh phẩm	Cái	0,0001
4	Hộp vận chuyển bệnh phẩm	Cái	0,001
5	Sinh phẩm chẩn đoán	Test	1,000
6	Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng	Test	1,200
7	Kit tách DNA	Test	2,200
8	Ngoại kiểm (nếu có)*		0,020
9	ống Falcol 50 ml	Cái	0,010
10	Eppendorf 1,7 ml	Tube	2,200
11	Eppendorf 0,2 ml	Tube	2,200
12	Đầu côn 10 µl có lọc	Cái	2,200
13	Đầu côn 30 µl	Cái	1,200
14	Đầu côn 200 µl có lọc	Cái	5,200
15	Đầu côn 1 ml có lọc	Cái	3,200
16	Water-DEPC Treated	ml	1,000
17	Giấy thấm	Cuộn	0,100
18	Giấy xét nghiệm	Tờ	2,000
19	Sổ lưu kết quả xét nghiệm	Tờ	0,001
20	Bút viết kính	Cái	0,020
21	Bút bi	Cái	0,010
22	Mũ	Cái	0,020
23	Khẩu trang	Cái	0,020
24	Găng tay	Đôi	0,100
25	Găng tay xử lý dụng cụ	Đôi	0,020
26	Quần áo bảo hộ	Bộ	0,005
27	Dung dịch nước rửa tay	ml	8,000
28	Cồn sát trùng tay nhanh	ml	1,000
29	Dung dịch khử trùng	ml	10,000
30	Khăn lau tay	Cái	0,010

* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Dịch quệt cổ tử cung, mảnh sinh thiết… 

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: Xem chi tiết phụ lục 3. 

Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: Xem chi tiết phụ lục 6.

Tiến hành kỹ thuật:

Bộ sinh phẩm HPV Genotype Real-time PCR (VD).

Tách chiết DNA.

Thực hiện phản ứng real-time PCR.

Thực hiện phản ứng reverse dlot blot: Thực hiện với những mẫu dương tính ở bước 2.2.  

Nhận định kết quả

Điều kiện của phản ứng

Chứng dương: có tín hiệu tại vị trí chứng dương.

Những genotyp nguy cơ cao: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68.

Những genotyp nguy cơ thấp: 6, 11, 42, 43, 61, 81.

Nhận định kết quả

Mẫu có tín hiệu tròn xanh xuất hiện tại vị trí tương ứng với genotype nào thì kết luận mẫu dương tính với genotype đó. Một mẫu có thể đồng nhiễm nhiều genotype.

Mẫu không có tín hiệu màu thì kết luận: “Mẫu nhiễm HPV genotype khác ngoài genotype của bộ kit”.

In hình kết quả 

Những sai sót và xử trí

Tất cả các mẫu đều dương tính kể cả chứng âm.

Nguyên nhân 1

Lô thí nghiệm bị ngoại nhiễm DNA hoặc sản phẩm PCR từ môi trường của khu vực thao tác hoặc nhiễm chéo giữa các mẫu. 

Khắc phục

Chiếu UV và vệ sinh khu vực thao tác bằng nước Javel để khử nhiễm. Tiến hành lại thí nghiệm thật cẩn thận.

Nguyên nhân 2

Kit bị ngoại nhiễm DNA hoặc sản phẩm PCR trong quá trình sử dụng. 

Khắc phụ

Thay kit mới và thực hiện quá trình như hướng dẫn ở nguyên nhân 1. Trường hợp này không thể lấy kết quả, phải khắc phục và tiến hành lại thí nghiệm. 

Tín hiệu dương tính yếu, có thể do rửa nhiều và quá lâu làm cho tín hiệu dương tính nhạt hoặc màng lai không sạch vẫn còn màu xanh sẽ khó đọc kết quả.

Khắc phục

Phải tuân thủ đúng điều kiện rửa.