Clostridium difficile pcr

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Phát hiện gen mã hóa cho 2 loại độc chất A và B của vi khuẩn Clostridium difficile từ mẫu phân.

Nguyên lý

Bằng kỹ thuật PCR sử dụng bộ kit C. difficile A/B (VD). 

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị

Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

Bộ lưu điện.

Máy ủ nhiệt.

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml.

Máy ly tâm 25000 x g.

Tủ lạnh 2°C – 8°C.

Tủ âm sâu (-20°C) hoặc (-70°C) (nếu có).

Máy vortex.

Tủ an toàn sinh học. 

Micropipettes các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 2 mẫu/lần thực hiện (VD).

STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị	Số lượng
1	C. difficile A/B kit (VD)	Test	1,000
2	Nước cất	ml	0,500
3	Khay đựng bệnh phẫm	Cái	0,100
4	Tube ly tâm 1.5 ml	Tube	2,000
5	PRC tube thể tích 200 µl	Tube	1,000
6	Đầu côn có lọc 1000 µl	cái	6,000
7	Đầu côn có lọc 200 µl	cái	12,000
8	Đầu côn có lọc 10 µl	cái	6,000
9	Micropipette 2-20 µl	cái	0,010
10	Micropipette 10-100 µl	cái	0,010
11	Micropipette 100-1000 µl	cái	0,010
12	Sổ lưu kết quả xét nghiệm	Tờ	0,001
13	Cồn 90 độ (vệ sinh dụng cụ)	ml	20,000
14	Cồn sát trùng tay nhanh	ml	2,000
15	Dung dịch nước rửa tay	ml	8,000
16	Khăn lau tay	Cái	0,030
17	Giấy trả kết quả xét nghiệm	Tờ	2,000
18	Bông	kg	0,010
19	Giấy y tế	Tờ	2,000
20	Giá đỡ PCR tube	Cái	0,001
21	Kẹp nhựa, marker	Cái	0,001
22	Tube Eppendorf	Cái	2,000
23	Tube đặt phản ứng	Cái	2,000
24	Khẩu trang	Cái	1,000
25	Găng tay không bột tal	Đôi	2,000
26	Quần áo bảo hộ	Cái	1,000
27	Mũ	Cái	1,000
28	QC (nếu thực hiện) *		0,100
29	EQAS (nếu thực hiện) *		0,005

* Ghi chú: 

Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Thu thập các mẫu phân vào các ống chứa kín, không cần chất bảo quản.

Mẫu phải được bảo quản ở 2 – 8ºC và làm xét nghiệm ngay lập tức hoặc giới hạn trong 24 giờ. Trong trường hợp khác, mẫu phải được đông lạnh ngay lập tức và được trữ lên tới 10 ngày ở nhiệt độ -20ºC hoặc lạnh hơn. 

Sự rã đông không được ảnh hưởng đến kết quả.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 3).

Tiến hành kỹ thuật

Chuẩn bị mẫu.

Tách chiết DNA.

Cài đặt máy luân nhiệt.

Chuẩn bị cho PCR mix.

Chạy phản ứng PCR.

Nhận định kết quả

FAM	HEX	Kết quả
Ct > 0	Không liên quan (Ct >0)	Dương tính
Ct = 0	Ct > 0	Âm tính
Ct = 0	Ct = 0	Bị ức chế

Kết quả chỉ có giá trị nếu:

Mẫu blank phải dương tính ở kênh HEX, nhưng âm tính ở kênh FAM.

Chứng dương phải dương tính ở kênh FAM.

Nếu 2 điều kiện gặp nhau, kết quả có giá trị và có khả năng phân tích kết quả.

Ngoài ra các kết quả khác đều không có giá trị.

Những sai sót và xử trí

Vấn đề 1

Không tín hiệu.

Sai kênh được chọn.

Hút sai dẫn tới bỏ quên 1 số thuốc thử hoặc mẫu.

Tác động ức chế của mẫu: DNA không đủ lượng hoặc không đủ độ tinh sạch.

Kiểm tra bộ kit được bảo quản đúng.

Kiểm tra hoạt động của máy luân nhiệt.

Vấn đề 2

Mật độ huỳnh quang quá thấp.

Hư thuốc nhuộm và/hoặc primers trong thuốc thử do điều kiện bảo quản không phù hợp.

Lượng mẫu và/hoặc độ tinh sạch thấp của DNA.

Vấn đề 3

Mật độ huỳnh quang thay đổi.

Master mix không được phối trộn tốt.

Bọt khí có trong ống PCR.