Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Phát hiện kháng thể IgM kháng virus dengue trong huyết thanh hoặc huyết tương.
Nguyên lý
Phát hiện kháng thể IgM đặc hiệu kháng virus dengue dựa trên nguyên lý của kỹ thuật ELISA (miễn dịch gắn enzyme) (VD).
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Dàn máy ELISA.
Máy ly tâm.
Tủ lạnh 2ºC – 8ºC.
Tủ âm sâu (- 20ºC hoặc – 70ºC) (nếu có).
Micropipette đơn kênh thể tích từ 10 µl đến 1000 µl.
Bộ pipetman 8 kênh (nếu có).
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Thực hiện xét nghiệm 01 mẫu/lần.
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Bông |
Kg |
0,001 |
|
2 |
Dây garô |
Cái |
0,001 |
|
3 |
Tube đựng bệnh phẩm |
Cái |
1,000 |
|
4 |
Sinh phẩm chẩn đoán** |
Test |
16,000 |
|
5 |
Chứng ngoại kiểm âm (nếu có) |
ml |
0,100 |
|
6 |
Chứng ngoại kiểm dương (nếu có) |
ml |
0,100 |
|
7 |
Ngoại kiểm (nếu có)* |
|
0.020 |
|
8 |
Đầu côn 1000 µl |
Cái |
3,000 |
|
9 |
Đầu côn 200 µl |
Cái |
5,000 |
|
10 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
11 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
12 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
13 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
14 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
15 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
16 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
17 |
Găng tay |
Đôi |
0,100 |
|
18 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
19 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
20 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
21 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
1,000 |
|
22 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10,000 |
|
23 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,010 |
Ghi chú:
* Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
** Nếu chỉ làm 01 mẫu vẫn phải mở 01 lọ kháng nguyên đủ cho 16 giếng bao gồm 11 mẫu bệnh phẩm + 5 mẫu chứng. Vì vậy nếu làm đơn lẻ 01 mẫu thì 01 bệnh phẩm phải chịu chi phí cho 15 giếng còn lại.
Bệnh phẩm
Huyết thanh hoặc huyết tương.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: xem chi tiết phụ lục 2.
Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: xem chi tiết phụ lục 6.
Tiến hành kỹ thuật
Bộ sinh phẩm Dengue Duo IgM capture ELISA – Pan Bio (VD).
|
Các bước |
Xét nghiệm định tính dengue IgM |
|
2.1 |
Để Số lượng sinh phẩm cần dùng ở nhiệt độ phòng 30 phút trước khi làm xét nghiệm. |
|
2.2 |
Đánh số, sắp xếp bệnh phẩm và viết sơ đồ theo thứ tự. |
|
2.3 |
Chuẩn bị dung dịch rửa. |
|
2.4 |
Pha loãng kháng nguyên. |
|
2.5 |
Pha loãng huyết thanh người bệnh, chứng âm, chứng dương và chứng cut-off. |
|
2.6 |
Trộn đều lượng kháng nguyên đã được pha loãng với một lượng tương đương Mab Tracer. Phức hợp Antigen – Mab Tracer để ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ. |
|
2.7 |
Cho chứng âm, chứng dương, chứng cut-off và bệnh phẩm đã pha loãng vào các giếng của phiến nhựa theo thứ tự hướng dẫn của quy trình. |
|
2.8 |
Đậy phiến nhựa và ủ. |
|
2.9 |
Rửa phiến nhựa. |
|
2.10 |
Lắc nhẹ phức hợp Antigen – Mab Tracer. Nhỏ phức hợp này vào mỗi giếng. |
|
2.11 |
Đậy phiến nhựa và ủ. |
|
2.12 |
Rửa phiến nhựa. |
|
2.13 |
Nhỏ dung dịch hiện màu vào mỗi giếng. |
|
2.14 |
Ủ phiến nhựa, không đậy và tránh ánh sáng. |
|
2.15 |
Nhỏ dung dịch dừng phản ứng. |
|
2.16 |
Đọc độ kết quả ở bước sóng 450 và 620nm trong vòng 30 phút sau khi dừng phản ứng. |
Nhận định kết quả
Kết quả được tính theo Đơn vị PanBio như sau:
Tính giá trị trung bình của ngưỡng (calibrator) rồi nhân với yếu tố ngưỡng (calibration factor = 0,62). Đây chính là giá trị ngưỡng:
ODCO1 + ODCO2+ ODCO3
CO = 0,62 x _________________________
3
OD bệnh phẩm
Đơn vị Panbio = 10 x __________________
OD giá trị ngưỡng
ﻣ Đơn vị PanBio
ﻣ Đơn vị PanBio = 9 – 11: Mẫu thử phải xét nghiệm lại.
ﻣ Đơn vị PanBio > 11: Mẫu thử dương tính, trong huyết thanh người bệnh có kháng thể IgM.
Những sai sót và xử trí
Sai sót
Có thể xảy ra hiện tượng âm tính giả hoặc dương tính giả, thông thường do:
Thực hiện sai các bước trong quy trình hướng dẫn.
Chứng âm và những mẫu bệnh phẩm âm tính bị nhiễm chéo bởi huyết thanh/huyết tương có nồng độ kháng thể cao.
Dung dịch cơ chất bị nhiễm bởi các tác nhân oxid hoá (thuốc tẩy, ion kim loại v.v…).
Dung dịch dừng phản ứng bị nhiễm bẩn.
Xử trí
Tuân thủ đúng các bước quy trình hướng dẫn của nhà sản xuất và hướng dẫn về độ ổn định hóa chất xét nghiệm trong bộ sinh phẩm sử dụng.
Kiểm tra và vệ sinh máy rửa thường xuyên trước và sau khi làm xét nghiệm.
Chia hóa chất (chất cộng hợp, dung dịch hiện màu và dừng phản ứng) vào ống nghiệm sạch trước mỗi lần nhỏ.
