Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Phát hiện DNA đặc trưng của virus dengue trong huyết thanh hoặc huyết tương ở người.
Nguyên lý
Xác định serotype của virus dengue dựa trên nguyên lý của kỹ thuật onestep RT-PCR.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Máy PCR.
Bộ lưu điện.
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml.
Máy ly tâm 25000 x g.
Máy ủ nhiệt.
Máy vortex.
Tủ lạnh 2ºC – 8ºC.
Tủ âm sâu (- 20ºC hoặc -70ºC).
Micropipette các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu/lần.
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Bông |
Kg |
0.001 |
|
2 |
Dây garô |
Cái |
0.001 |
|
3 |
Cồn |
ml |
1.000 |
|
4 |
Bơm kim tiêm |
Cái |
1.000 |
|
5 |
Panh |
Cái |
0.0001 |
|
6 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0.0001 |
|
7 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Cái |
0.001 |
|
8 |
Tube đựng bệnh phẩm |
Cái |
1.000 |
|
9 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1.000 |
|
10 |
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng |
Test |
1.000 |
|
11 |
Kit tách RNA |
Test |
2.000 |
|
12 |
ống Falcol 50 ml |
Cái |
0.010 |
|
13 |
Eppendorf 1,7 ml |
Tube |
2.000 |
|
14 |
Eppendorf 0,2 ml |
Tube |
2.000 |
|
15 |
Đầu côn 10 µl có lọc |
Cái |
2.000 |
|
16 |
Đầu côn 30 µl |
Cái |
1.200 |
|
17 |
Đầu côn 200 µl có lọc |
Cái |
5.200 |
|
18 |
Đầu côn 1 ml có lọc |
Cái |
3.200 |
|
19 |
Ethanol BDH |
ml |
2.000 |
|
20 |
Water-DEPC Treated |
ml |
1.000 |
|
21 |
Thạch |
Gam |
0.075 |
|
22 |
Ladder |
ml |
0.0025 |
|
23 |
Blue Juice Gel loading dye |
ml |
0.003 |
|
24 |
Ethidium Bromide |
ml |
0.1 |
|
25 |
TAE Buffer |
ml |
0.1 |
|
26 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0.100 |
|
27 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2.000 |
|
28 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0.001 |
|
29 |
Bút viết kính |
Cái |
0.020 |
|
30 |
Bút bi |
Cái |
0.010 |
|
31 |
Mũ |
Cái |
0.020 |
|
32 |
Khẩu trang |
Cái |
0.020 |
|
33 |
Găng không có bột tal |
Đôi |
0.500 |
|
34 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0.020 |
|
35 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0.005 |
|
36 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8.000 |
|
37 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1.000 |
|
38 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10.000 |
|
39 |
Khăn lau tay |
Cái |
0.010 |
* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm)..
Bệnh phẩm
Huyết thanh hoặc huyết tương chống đông EDTA.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: Xem chi tiết phụ lục 2.
Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: Xem chi tiết phụ lục 6.
Tiến hành kỹ thuật:
Bộ kit one-step RT-PCR định type virus dengue (VD).
Tách chiết RNA tổng số.
Thực hiện phản ứng RT-PCR.
Điện di và phát hiện sản phẩm.
Nhận định kết quả
Điều kiện của phản ứng
Chứng dương có ít nhất một trong các vạch sản phẩm tương ứng với các type của virus dengue như sau:
Virus Dengue type 1: 482 cặp bazơ.
Virus Dengue type 2: 119 cặp bazơ.
Virus Dengue type 3: 290 cặp bazơ.
Virus Dengue type 4: 392 cặp bazơ.
Chứng âm không có các vạch sản phẩm trên.
Phân tích mẫu
Dựa vào độ dài dải băng để kết luận type virus dengue gây bệnh: những mẫu có vạch sản phẩm PCR tương ứng với 1 trong 4 type trên thì kết luận dương tính với virus dengue type đó.
Những mẫu không có vạch sản phẩm nào thì kết luận không tìm thấy virus dengue.
Những sai sót và xử trí
Trong trường hợp không có sản phẩm PCR, chứng nội cũng không lên cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết RNA tổng số, chất lượng sinh phẩm, và thực hiện lại toàn bộ xét nghiệm.
