ĐỊNH LƯỢNG AMH GEN II
(Anti Mullerian Hormon)
AMH là một dimer glycoprotein gồm 2 monome có trọng lượng phân tử 72 kDa liên kết với nhau bằng cầu nối disunfit. AMH là hormon ức chế ống Muller (hai ống phôi sẽ phát triển thành đường sinh dục nữ). Ở nam giới, AMH được sản sinh bởi tế bào Sertoli (trong tinh hoàn). AMH tiếp tục được hai tinh hoàn tiết ra tới thời kỳ dậy thì và sau đó giảm chậm dần sau dậy thì đến mức thấp (dạng lắng cặn). Ở nữ giới, AMH được các tế bào hạt buồng trứng tiết ra với mức độ thấp sau sinh tới thời kỳ mãn kinh và sau đó giảm tới mức không thể phát hiện được.
NGUYÊN LÝ
Dùng kỹ thuật ELISA để định lượng AMH trong huyết thanh và huyết tương chống đông bằng lithium heparin ở người.
Dựa vào tính đặc hiệu của kháng nguyên-kháng thể, theo phương pháp sandwich: Trong xét nghiệm này calibrator, control và mẫu được ủ trong các giếng đã được phủ kháng thể AMH. Sau lần ủ và rửa thứ nhất, bổ sung phức hợp kháng thể AMH Gen II-biotin vào từng giếng. Sau lần ủ và rửa thứ hai, bổ sung enzym liên hợpStreptavidin vào giếng. Sau lần ủ và rửa thứ ba, bổ sung cơ chất TMB vào giếng. Cuối cùng bổ sung dung dịch ngừng phản ứng. Đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ AMH có trong mẫu thử, được đo với bước sóng kép 450nm và giữa 600 – 630 nm.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Bác sĩ, cử nhân, kỹ thuật viên được đào tạo với máy Evolis Twin Plus
Phương tiện, hóa chất
Máy phân tích ELISA (có thể Evolis Twin Plus)
Thuốc thử được cung cấp của hãng Beckman Coulter (Mã: A79765)
+ Đĩa phản ứng (96 giếng)
+ Phức hợp kháng thể AMH thế hệ thứ 2-biotin
+ Cơ chất TMB
+ Dung dịch rửa I
+ Dung dịch pha loãng
+ Dung dịch ngừng phản ứng A
+ Phức Enzym liên hợp-Streptavidin (HRP)
+ Dung dịch đệm
Trong đó: Enzym liên hợp-Streptavidin là Streptavidin liên hợp với HRP (Horseradish Peroxidase). TMB: 3,3’,5,5’ tetramethyl-benzidine.
Thuốc thử và dụng cụ cần nhưng không được cung cấp
+ AMH Gen II Calibrator và Control A79766
+ Pipet chính xác loại 10-1000 μl
+ Các tube
+ Đầu côn pipet dùng một lần
+ Máy lắc, tốc độ 600-800 vòng/phút
+ Máy trộn kiểu votex
+ Vải thấm hút
+ Nước khử ion
Người bệnh
Không cần nhịn ăn và không phụ thuộc chu kỳ kinh nguyệt (nữ)
Đối với phụ nữ: xét nghiệm AMH được chỉ định để:
Đánh giá khả năng sinh sản của buồng trứng
Đánh giá đáp ứng của buồng trứng đối với liệu pháp kích buồng trứng
Góp phần chẩn đoán hội chứng buồng trứng đa nang.
Đánh giá và theo dõi ung thư buồng trứng.
Dự báo thời gian mãn kinh.
Đối với bé trai: xét nghiệm AMH được chỉ định để:
Chẩn đoán phân biệt rối loạn giới tính
Chẩn đoán tinh hoàn lạc chỗ
Phiếu xét nghiệm
Phiếu xét nghiệm theo mẫu bệnh viện và Bộ Y tế quy định, có ghi đầy đủ thông tin người bệnh.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Lấy bệnh phẩm
Sử dụng huyết thanh hoặc huyết tương chống đông bằng heparin lithium.
Để co cục máu rồi ly tâm, tách huyết thanh ra tube, đậy chặt nắp, có thể bảo quản ở 2 – 8°C trong 48 giờ, lâu hơn cần bảo quản ở – 200C. Tránh làm đông và rã đông nhiều lần.
Tiến hành kỹ thuật
Chuẩn bị mẫu
Đối với mẫu trẻ sơ sinh nam cần pha loãng mẫu với dung dịch pha loãng theo tỉ lệ 1:10 trước khi xét nghiệm
Đối với các mẫu khác thì không cần pha loãng.
Chuẩn bị thuốc thử:
Đưa tất cả thuốc thử về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
Dung dịch rửa:
Hòa loãng 10 lần dung dịch rửa I với nước khử ion, ổn định 1 tháng ở nhiệt độ phòng.
Giếng:
Chọn số giếng theo yêu cầu, những giếng còn lại để trong bao kín có hạt chống ẩm.
Chuẩn:
Từ A đến G với nồng độ lần lượt là: 0 ng/mL; 0,16 ng/mL; 0,4 ng/mL; 1,2 ng/mL; 4,0 ng/mL; 10,0 ng/mL và 22,5 ng/mL.
Bảo quản ở – 20o C sau khi nhận hàng. Để sử dụng nhiều lần, chia nhỏ và để – 20oC.
Sau lần sử dụng đầu tiên, ống đã rã đông ổn định 7 ngày khi bảo quản ở 2 – 8o C
Không rã đông quá 2 lần
Chất chứng:
Mức 1 và mức 2
Được giữ đông sau khi nhận hàng ở – 20o C. Để sử dụng nhiều lần, chia nhỏ và để ở -20o C.
Sau lần sử dụng đầu tiên, ống đã rã đông ổn định 7 ngày khi bảo quản ở 2 – 8o C – Không rã đông quá 2 lần
Tiến hành
Tiến hành theo quy trình cài đặt trên máy tự động EVOLIS TWIN PLUS.
Tổng thời gian hoàn thành xét nghiệm này khoảng 190 phút
Tiến hành vẽ đường cong chuẩn, khi QC đạt mới tiến hành đo mẫu
Các bước tiến hành như sau:
+ Đánh dấu các giếng cần sử dụng
+ Hút 20 μl mỗi calibrator, control hoặc mẫu người bệnh vào các giếng
+ Bổ sung thêm 100 μl dung dịch đệm vào mỗi giếng
+ Ủ trên máy lắc (tốc độ khoảng 600 – 800 vòng/phút) trong 60 phút ở nhiệt độ phòng
+ Rửa các giếng 5 lần với 400 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa
+ Hút 100 μl phức hợp kháng thể AMH Gen II-biotin vào mỗi giếng
+ Ủ trên máy lắc (tốc độ 600 – 800 vòng/phút) trong 60 phút ở nhiệt độ phòng
+ Rửa các giếng 5 lần với 400 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa
+ Hút 100 μl phức enzym liên hợp – streptavidin vào mỗi giếng
+ Ủ trên máy lắc (tốc độ khoảng 600-800 vòng/phút) trong 30 phút ở nhiệt độ phòng
+ Rửa các giếng 5 lần với 400 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa
+ Hút 100 μl dung dịch tạo màu TMB vào mỗi giếng. Tránh tiếp xúc trực tiếp ánh sáng.
+ Ủ trên máy lắc 8-12 phút ở nhiệt độ phòng.
+ Hút 100 μl dung dịch ngừng phản ứng vào mỗi giếng
+ Tiến hành đo
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Đối với phụ nữ
Đánh giá khả năng sinh sản của buồng trứng: Nồng độ AMH trong máu (tính bằng ng/mL) tương quan trực tiếp với số lượng nang trứng, ít thay đổi trong chu kỳ kinh nguyệt nên có thể sử dụng để đánh giá khả năng sinh sản của buồng trứng tốt hơn so với FSH
Khả năng sinh sản tối ưu: 4,0 – 6,8 ng/mL; khả năng sinh sản tốt: 2,2 – 4,0 ng/mL; khả năng sinh sản kém: 0,3 – 2,2 ng/mL; khả năng sinh sản rất kém: 0,0 – 0,3ng/mL
Đánh giá đáp ứng của buồng trứng: đối với liệu pháp kích buồng trứng: Nồng độ AMH cũng tương quan chặt chẽ với số lượng noãn nên có thể sử dụng để đánh giá đáp ứng của buồng trứng đối với liệu pháp kích buồng trứng để phục vụ cho liệu pháp thụ tinh trong ống nghiệm IVF (In vitro fertilization) hoặc liệu pháp tiêm tinh trùng vào bào tương của trứng ICSI (Intracytoplasmic sperm injection) trong thụ tinh nhân tạo.
Chẩn đoán Hội chứng buồng trứng đa nang: thường AMH > 6,8 ng/mL.
Đánh giá và theo dõi ung thư buồng trứng: nồng độ AMH có thể được sử dụng để chẩn đoán ung thư tế bào granulosa buồng trứng với độ nhạy khoảng 76 đến 93%. Nồng độ AMH giảm vài ngày sau phẫu thuật khối u buồng trứng và lại tăng lên nếu u tái phát
Dự báo thời gian mãn kinh: Ở phụ nữ, nồng độ AMH giảm dần theo tuổi. AMH có giá trị dự báo thời kỳ mãn kinh tốt hơn so với FSH. Nếu AMH
Đối với bé trai
Chẩn đoán phân biệt rối loạn giới tính: nồng độ AMH trong máu bằng 0 hoặc rất thấp và nồng độ các androgen trong máu thấp: không có tinh hoàn hoặc không phát triển giới tính nam.
Chẩn đoán tinh hoàn lạc chỗ: khám không thấy có tinh hoàn nhưng nồng độ AMH và các androgen bình thường
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Có một số sai sót thường gặp:
Lấy sai ống àlấy lại
Tuyệt đối không sử dụng máu vỡ hồng cầu, máu đục, máu vàng
Mẫu máu ở người bệnh có dùng thuốc chống đông thì thời gian co cục máu lâu hơn trước khi ly tâm (hơn 30 phút)
Mẫu có kết quả vượt quá 22,5 ng/mL thì phải hòa loãng mẫu với dung dịch pha loãng.
Những sai sót do máy thì hỏi kỹ sư để xử trí.
Lưu ý Calibrator và QC bảo quản thật tốt để có đường cong chuẩn đạt yêu cầu.
