ĐỊNH LƯỢNG GLP-1 TOÀN PHẦN
(Total Glucagon-like peptid-1)
GLP-1 có tiền chất là proglucagon, có thời gian bán hủy dưới 2 phút. Nguồn chính của GLP-1 trong cơ thể là các tế bào L của ruột tiết GLP-1 như một hocmon ruột. Nó là một hocmon chống tăng đường huyết mạnh, như một phương pháp điều trị tiềm năng của bệnh đái tháo đường với các chức năng sinh lý sau: tăng tiết insulin từ tuyến tụy, giảm tiết glucagon từ tuyến tụy, tăng độ nhạy insulin trong cả hai tế bào alpha và beta, tăng khối lượng các tế bào beta và tiết insulin, ức chế tiết acid dạ dày đổ trong dạ dày, làm giảm lượng thức ăn bằng cách tăng cảm giác no trong não, thúc đẩy sự nhạy cảm insulin.
NGUYÊN LÝ
Dùng kỹ thuật ELISA để định lượng GLP-1 toàn phần trong huyết tương.
Dựa vào tính đặc hiệu của kháng nguyên – kháng thể theo phương pháp sandwich: Standard, control và mẫu được thêm vào các giếng đã được phủ với streptavidin. Sau đó, hỗn hợp kháng thể bắt giữ và kháng thể đánh dấu được thêm vào các giếng. Sau khi ủ, một phức hợp miễn dịch “sandwich” được hình thành là “ Streptavidin-kháng thể bắt giữ -GLP–1-kháng thể đánh dấu” gắn chặt lên đĩa. Các thành phần không kết hợp sẽ được rửa đi. Để phát hiện được phức hợp miễn dịch này, cơ chất sẽ được thêm vào, rồi thêm dung dịch ngừng phản ứng vào. Đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ GLP-1 toàn phần trong mẫu, được đo ở bước sóng 450 nm.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Bác sĩ, cử nhân, kỹ thuật viên chuyên ngành hóa sinh được đào tạo với máy Evolis Twin Plus.
Phương tiện, hóa chất
Máy phân tích ELISA (có thể Evolis Twin Plus)
Thuốc thử được cung cấp của hãng DGR, Đức (EIA -5095)
+ Đĩa phản ứng (96 giếng)
+ Dung dịch hòa loãng kháng thể đánh dấu
+ Chuẩn: 5 lọ
+ Cơ chất TMB
+ Control cao và thấp
+ Dung dịch rửa
+ Kháng thể đánh dấu
+ Dung dịch ngừng phản ứng
+ Kháng thể bắt giữ
Trong đó TMB: 3,3’,5,5’ tetramethyl-benzidine
Kháng thể đánh dấu là kháng thể liên hợp HRP (Horseradish Peroxidase)
Kháng thể bắt giữ là kháng thể liên hợp biotin
Thuốc thử và dụng cụ cần nhưng không được cung cấp
+ Pipet chính xác 25 μl, 50 μl, 100 μl, và 1000 μl
+ Các tube
+ Đầu côn pipet dùng một lần
+ Nước cất
+ Chất ức chế DPP – 4 (dipeptidyl peptidase 4): có tác dụng tăng GLP-1, giảm glucagon và lượng đường trong máu.
Người bệnh
Người bệnh lúc đói và no ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm (đói cho kết quả thấp hơn khi no)
Phiếu xét nghiệm
Phiếu xét nghiệm theo mẫu bệnh viện và Bộ Y tế quy định, có ghi đầy đủ thông tin người bệnh.
Các bước tiến hành
Lấy bệnh phẩm
Sử dụng huyết tương chống đông bằng EDTA
Khuyến cáo thêm một lượng thích hợp chất ức chế DPP-4 vào máu toàn phần EDTA đã thu thập. Đảo ngược ống để trộn đều và đặt ống vào bồn nước đá. Ly tâm ống 3000 vòng/phút trong 10 phút trên máy ly tâm lạnh.
Mẫu nên được lưu trữ ở 2 – 8° C nếu được làm trong vòng 3 giờ từ khi thu thập, lâu hơn thì lưu trữ ở -70° C. Chỉ rã đông một lần.
Tiến hành kỹ thuật
Chuẩn bị thuốc thử
Đưa tất cả thuốc thử về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
Dung dịch rửa
Hòa 20 ml dung dịch rửa với 580 ml nước cất để được dung dịch 600 ml. Sau khi pha, ổn định đến ngày hết hạn ở nhiệt độ phòng.
Chuẩn
S1 – S5 với các nồng độ lần lượt : 0 pmol/L; 2,1 pmol/L; 6,0 pmol/L; 17,3 pmol/L; 54,0 pmol/L
Ổn định đến ngày hết hạn khi bảo quản ở 2 – 8o C
Control
Control mức thấp : 4,1 pmol/L và control mức cao: 13,7 pmol/L
Ổn định đến ngày hết hạn khi bảo quản ở 2 – 8o C
Tiến hành
Tiến hành theo quy trình cài đặt trên máy tự động EVOLIS TWIN PLUS.
Tổng thời gian hoàn thành xét nghiệm này khoảng 1465 phút (gần 25 giờ)
Vẽ đường cong chuẩn trước, control đạt thì tiến hành đo mẫu.
* Các bước tiến hành như sau:
+ Sử dụng số giếng cần thiết để vẽ đường cong chuẩn (S), control (C) và đo mẫu:
|
Hàng |
Dải 1 |
Dải 2 |
Dải 3 |
|
A |
S1 |
S5 |
Mẫu 2 |
|
B |
S1 |
S5 |
Mẫu 2 |
|
C |
S2 |
C 1 |
Mẫu 3 |
|
D |
S2 |
C 1 |
Mẫu 3 |
|
E |
S3 |
C 2 |
Mẫu 4 |
|
F |
S3 |
C 2 |
Mẫu 4 |
|
G |
S4 |
Mẫu 1 |
|
|
H |
S4 |
Mẫu 1 |
|
+ Chuẩn bị hỗn hợp kháng thể GLP-1 toàn phần bằng cách trộn kháng thể đánh dấu với kháng thể bắt giữ (cả hai kháng thể đã pha loãng với dung dịch pha loãng kháng thể đánh dấu theo tỉ lệ 1:21)
Mỗi dải: trộn 1 ml dung dịch pha loãng kháng thể đánh dấu với 50 μl kháng thể bắt giữ và 50 μl kháng thể đánh dấu vào tube sạch
+ Hút 100 μl mỗi calibrator, control hoặc mẫu người bệnh vào các giếng
+ Hút 100 μl hỗn hợp kháng thể cho tiếp vào các giếng.
+ Phủ giấy kín và ủ ở 2 – 8o C trong 20 – 24 giờ
+ Lấy giấy phủ ra, loại bỏ các chất ra khỏi giếng, rửa các giếng 5 lần với 350 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rữa.
+ Hút 200 μl cơ chất TMB vào mỗi giếng.
+ Ủ 20 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng
+ Hút 50 μl dung dịch ngừng phản ứng vào mỗi giếng, trộn đều
+ Tiến hành đo với bước sóng kép 450/620 nm hoặc 450/650 nm trong 10 phút
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Giá trị tham khảo:
Khi đói: 0,3 – 18,5 pmol/L (nhịn tối thiểu 12h)
Khi ăn bình thường : 2,1 – 24,7 pmol/L
Ý nghĩa lâm sàng: GLP-1 được ứng dụng trong điều trị và theo dõi bệnh đái tháo đường vì GLP-1 có tác dụng hạ đường huyết.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Có một số sai sót thường gặp:
Lấy sai ống àlấy lại
Tuyệt đối không sử dụng máu vỡ hồng cầu, máu đục, máu vàng
Mẫu máu ở người bệnh có dùng thuốc chống đông thì thời gian co cục máu lâu hơn trước khi ly tâm (hơn 30 phút)
Mẫu có kết quả vượt quá 54 pmol/L thì phải hòa loãng mẫu với dung dịch hòa loãng.
Những sai sót do máy thì hỏi kỹ sư để xử trí.
Lưu ý Calibrator và QC bảo quản thật tốt để có đường cong chuẩn đạt yêu cầu.
