ĐỊNH LƯỢNG LEPTIN
Leptin là một hocmon có trọng lượng phân tử 16 kDa gồm 167 axit amin, đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh năng lượng ăn vào và năng lượng tiêu thụ, bao gồm cả sự thèm ăn/đói và quá trình trao đổi chất. Nó là một trong những hocmon có nguồn gốc từ mỡ quan trọng nhất. Gen Ob(Lep) trong đó Ob là obese, và Lep là leptin nằm trên nhiễm sắc thể số 7 của người. Leptin tác động lên các thụ thể trong vùng dưới đồi của não để ức chế sự thèm ăn. Sự vắng mặt của leptin (hoặc thụ thể của nó) dẫn đến không kiểm soát được lượng thức ăn và dẫn đến béo phì.
NGUYÊN LÝ
Dùng kỹ thuật ELIS để định lượng leptin trong huyết thanh và huyết tương người. Dựa vào tính đặc hiệu của kháng nguyên-kháng thể theo phương pháp sandwich: các giếng được phủ với kháng thể đơn dòng đặc hiệu cho leptin. Mẫu người bệnh có chứa leptin sẽ được ủ trong các giếng cùng với antiserum (kháng thể liên hợp biotin đơn dòng). Một phức hợp sandwich hình thành. Sau khi ủ và rửa đi những phần không kết hợp, enzym liên hợp được thêm vào, tiếp là cơ chất và cuối cùng là thêm dung dịch ngừng phản ứng. Đậm độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ leptin trong mẫu, được đo ở bước sóng 450 nm.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Bác sĩ, cử nhân, kỹ thuật viên được đào tạo với máy Evolis Twin Plus
Phương tiện, hóa chất
Máy phân tích ELIS (có thể Evolis Twin Plus)
Thuốc thử được cung cấp của hãng DRG, Đức (EI -2395)
Đĩa phản ứng (96 giếng) + Enzym liên hợp
Chuẩn: 6 lọ (dạng đông khô) + Cơ chất
Control cao và thấp (dạng đông khô) + Dung dịch rửa
Dung dịch đệm + Dung dịch ngừng phản ứng + Antiserum
Thuốc thử và dụng cụ cần nhưng không được cung cấp
Pipet chính xác + Các tube
Đầu côn pipet dùng một lần + Nước cất
Người bệnh
Người bệnh không cần nhịn đói hay đòi hỏi yêu cầu gì đặc biệt
Phiếu xét nghiệm
Phiếu xét nghiệm theo mẫu bệnh viện và Bộ Y tế quy định, có ghi thông tin đầy đủ của người bệnh.
Các bước tiến hành
Lấy bệnh phẩm
Sử dụng huyết thanh hoặc huyết tương
Huyết thanh: Thu thập máu, để co cục máu hoàn toàn, ly tâm ở nhiệt độ phòng. Những người bệnh dùng thuốc chống đông cần để thời gian co cục máu lâu hơn.
Huyết tương: Ly tâm ngay sau khi thu thập máu vào ống có chất chống đông.
Bảo quản: Mẫu nên được tách tube và bảo quản ở 2 – 8o C trong 24 giờ, lâu hơn ở – 20o C, mẫu sau khi rã đông nên được lắc đều trước khi dùng.
Tiến hành kỹ thuật
Chuẩn bị thuốc thử
Đưa tất cả thuốc thử về nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
Dung dịch rửa:
Hòa 30 ml dung dịch rửa với 1170 ml nước cất để được dung dịch 1200 ml.
Sau khi pha, ổn định 2 tuần ở nhiệt độ phòng.
Chuẩn:
Nồng độ chuẩn từ S0 – S5 lần lượt là: 0 ng/mL; 2 ng/mL; 5 ng/mL; 25 ng/mL; 50 ng/mL; 100 ng/mL
Cho 0,5 ml nước cất vào lọ chuẩn (dạng đông khô), để tối thiểu 10 phút, lắc đều trước khi sử dụng.
Ổn định ít nhất 6 tuần khi bảo quản ở 2 – 8o C, lâu hơn ở – 20o C
Control: Lot: 2395
Control mức thấp : 1,62 – 4,28 ng/mL và Control mức cao: 51,52 – 76,20 ng/mL
Cho 0,5 ml nước cất vào lọ Control (dạng đông khô), để tối thiểu 10 phút, lắc đều trước khi sử dụng.
Ổn định ít nhất 6 tuần khi bảo quản ở 2 – 8o C, lâu hơn ở – 20o C
Tiến hành
Tiến hành theo quy trình cài đặt trên máy tự động EVOLIS TWIN PLUS.
Tổng thời gian hoàn thành xét nghiệm này khoảng 210 phút.
Vẽ đường cong chuẩn trước, control đạt thì tiến hành đo mẫu.
Các bước tiến hành như sau:
Hút 15 μl mỗi calibrator, control hoặc mẫu người bệnh vào các giếng.
Hút 100 μl dung dịch đệm tiếp vào các giếng. Trộn đều trong 10 giây.
Ủ 120 phút trong nhiệt độ phòng.
Rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa.
Hút 100 μl ntiserum vào mỗi giếng.
Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa.
Hút 100 μl enzym liên hợp vào mỗi giếng.
Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Rửa các giếng 3 lần với 300 μl dung dịch rửa cho mỗi giếng trong một lần rửa + Hút 100 μl cơ chất vào mỗi giếng.
Ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng.
Hút 50 μl dung dịch ngừng phản ứng vào mỗi giếng.
Tiến hành đo trong vòng 10 phút.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Giá trị tham khảo:
Nam: 2,05 – 5,63 ng/mL Nữ: 3,63 – 11,09 ng/mL.
Ý nghĩa lâm sàng:
Mức độ leptin giảm sau khi nhịn ăn ngắn hạn (24 -72 giờ), béo phì, mất ngủ, tập thể dục…
Mức độ leptin tăng khi bị căng thẳng cảm xúc…
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Có một số sai sót thường gặp:
Tuyệt đối không sử dụng máu vỡ hồng cầu, máu đục, máu vàng.
Không dùng mẫu có chứa Natri azide.
Mẫu máu ở người bệnh có dùng thuốc chống đông thì thời gian co cục máu lâu hơn trước khi ly tâm (hơn 30 phút).
Mẫu có kết quả vượt quá 100 ng/mL thì phải hòa loãng mẫu với dung dịch S0.
Những sai sót do máy thì hỏi kỹ sư để xử trí.
Lưu ý Calibrator và QC bảo quản thật tốt để có đường cong chuẩn đạt yêu cầu.
