Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Phát hiện gen đặc trưng của Enterovirus 71 (EV71) từ bệnh phẩm dịch não tủy, phết họng, phết trực tràng.
Nguyên lý
Phát hiện gen đặc trưng của Enterovirus 71 dựa trên nguyên lý của kỹ thuật real-time RT-PCR.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Trang thiết bị
Máy realime PCR và hệ thống máy vi tính.
Bộ lưu điện.
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml.
Máy ly tâm 25000 x g
Máy ủ nhiệt – Máy vortex.
Tủ lạnh 2ºC – 8ºC.
Tủ âm sâu (-20ºC hoặc -70ºC).
Micropipette các thể tích từ 5 µl -1000 µl.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu /lần.
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Tăm bông vô trùng |
kg |
0,001 |
|
2 |
Găng không bột tal |
cái |
0,500 |
|
3 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
4 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Test |
0,001 |
|
5 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1,000 |
|
6 |
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng |
Test |
1,200 |
|
7 |
Kit tách chiết DNA |
Test |
2,200 |
|
8 |
Ngoại kiểm (nếu có)* |
|
0,020 |
|
9 |
Ống Falcol 50 ml |
Cái |
0,010 |
|
10 |
Eppendorf 1,7 ml |
Tube |
2,200 |
|
11 |
Eppendorf 0,2 ml |
Tube |
2,200 |
|
12 |
Đầu côn 10 µl có lọc |
Cái |
1,000 |
|
13 |
Đầu côn 30 µl |
Cái |
1,200 |
|
14 |
Đầu côn 200 µl có lọc |
Cái |
5,200 |
|
15 |
Đầu côn 1ml có lọc |
Cái |
3,200 |
|
16 |
Water-DEPC treated |
ml |
1,000 |
|
17 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
18 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
19 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
20 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
21 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
22 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
23 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
24 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
25 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
26 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
27 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
28 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10,000 |
|
29 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,010 |
* Ghi chú:
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Dịch não tủy, phết họng, phết trực tràng.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: Xem chi tiết phụ lục 3.
Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: Xem chi tiết phụ lục 6.
Tiến hành kỹ thuật:
Bộ sinh phẩm EV/EV71 RT TQ PCR Kit (VD).
Thu nhận mẫu
Thu nhận mẫu và lưu mẫu trước khi tách chiết theo quy định.
Tách chiết rna
Tách chiết RNA tổng số.
Tổng hợp cdna
Thực hiện phản ứng RT với mồi ngẫu nhiên phiên mã ngược RNA trong dịch tách chiết RNA.
Thực hiện phản ứng real-time pcr
Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay đá lạnh hoặc đá đang tan.
Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube.
Cho chứng dương và chứng âm hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube EV/EV 71 rPCR mix. Xong đặt các tube vào máy real-time PCR.
Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình Real-time PCR.
Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đạt trên máy real-time PCR.
Chọn màu “FAM”, “HEX” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.
Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.
Lưu file dữ liệu vào máy tính.
Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
Nhận định kết quả
Điều kiện của phản ứng
Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM và màu HEX tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính).
Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM và màu HEX âm tính.
Chứng nội tại có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM dương tính.
Phân tích mẫu
Mẫu dương tính EV: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng với màu của từng tác nhân và bắt đầu từ chu kỳ 40 trở về trước.
Mẫu nghi ngờ: Mẫu có đường biểu diễn dương tính và bắt đầu sau chu kỳ 40, đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm.
Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính.
In đồ thị kết quả
Những sai sót cần xử trí
Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
Nguyên nhân
Có thể mẫu âm thật sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
Khắc phục
Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.
Trừ những mẫu sự cố, tất cả các mẫu bình thường đều có thể lấy kết quả.
