Nội dung

Ev71 real-time pcr

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Phát hiện gen đặc trưng của Enterovirus 71 (EV71) từ bệnh phẩm dịch não tủy, phết họng, phết trực tràng.

Nguyên lý

Phát hiện gen đặc trưng của Enterovirus 71 dựa trên nguyên lý của kỹ thuật real-time RT-PCR.

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất

Trang thiết bị

Máy realime PCR và hệ thống máy vi tính.

Bộ lưu điện.

Tủ an toàn sinh học cấp 2. 

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml.

Máy ly tâm 25000 x g

Máy ủ nhiệt – Máy vortex.

Tủ lạnh 2ºC – 8ºC.

Tủ âm sâu (-20ºC hoặc -70ºC).

Micropipette các thể tích từ 5 µl -1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu /lần.

STT

Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao

Đơn vị

Số lượng

1

Tăm bông vô trùng

kg

0,001

2

Găng không bột tal

cái

0,500

3

Khay đựng bệnh phẩm

Cái

0,0001

4

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Test

0,001

5

Sinh phẩm chẩn đoán

Test

1,000

6

Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng

Test

1,200

7

Kit tách chiết DNA

Test

2,200

8

Ngoại kiểm (nếu có)*

 

0,020

9

Ống Falcol 50 ml  

Cái

0,010

10

Eppendorf 1,7 ml

Tube

2,200

11

Eppendorf 0,2 ml

Tube

2,200

12

Đầu côn 10 µl có lọc

Cái

1,000

13

Đầu côn 30 µl  

Cái

1,200

14

Đầu côn 200 µl có lọc  

Cái

5,200

15

Đầu côn 1ml có lọc

Cái

3,200

16

Water-DEPC treated

ml

1,000

17

Giấy thấm 

Cuộn

0,100

18

Giấy xét nghiệm

Tờ

2,000

19

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Tờ

0,001

20

Bút viết kính

Cái

0,020

21

Bút bi

Cái

0,010

22

Cái

0,020

23

Khẩu trang

Cái

0,020

24

Găng tay xử lý dụng cụ

Đôi

0,020

25

Quần áo bảo hộ

Bộ

0,005

26

Dung dịch nước rửa tay

ml

8,000

27

Cồn sát trùng tay nhanh

ml

1,000

28

Dung dịch khử trùng

ml

10,000

29

Khăn lau tay

Cái

0,010

* Ghi chú: 

 Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Dịch não tủy, phết họng, phết trực tràng.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.

Các bước tiến hành

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: Xem chi tiết phụ lục 3.

Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: Xem chi tiết phụ lục 6.

Tiến hành kỹ thuật:

Bộ sinh phẩm EV/EV71 RT TQ PCR Kit (VD).

Thu nhận mẫu

Thu nhận mẫu và lưu mẫu trước khi tách chiết theo quy định. 

Tách chiết rna 

Tách chiết RNA tổng số.

Tổng hợp cdna 

Thực hiện phản ứng RT với mồi ngẫu nhiên phiên mã ngược RNA trong dịch tách chiết RNA.

Thực hiện phản ứng real-time pcr

Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay đá lạnh hoặc đá đang tan.

Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube.

Cho chứng dương và chứng âm hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube EV/EV 71 rPCR mix. Xong đặt các tube vào máy real-time PCR.

Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình Real-time PCR.

Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đạt trên máy real-time PCR.

Chọn màu “FAM”, “HEX” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.

Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.

Lưu file dữ liệu vào máy tính.

Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

Nhận định kết quả

Điều kiện của phản ứng

Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM và màu HEX tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính). 

Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM và màu HEX âm tính.

Chứng nội tại có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM dương tính.

Phân tích mẫu

Mẫu dương tính EV: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng với màu của từng tác nhân và bắt đầu từ chu kỳ 40 trở về trước. 

Mẫu nghi ngờ: Mẫu có đường biểu diễn dương tính và bắt đầu sau chu kỳ 40, đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm.

Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính.

In đồ thị kết quả

Những sai sót cần xử trí

Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.

Nguyên nhân

Có thể mẫu âm thật sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.

Khắc phục

Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.

Trừ những mẫu sự cố, tất cả các mẫu bình thường đều có thể lấy kết quả.