Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Đếm số lượng bản copies của HBV DNA trong một đơn vị thể tích (ml) huyết tương.
Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật Real-time PCR.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Máy ly tâm thường.
Tủ lạnh 2°C – 8°C.
Tủ âm sâu (-20°C) hoặc (-70°C) (nếu có).
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Máy vortex.
Hệ thống máy tách chiết tự động (RNA, DNA) và định lượng COBAS®AmpliPrep/COBAS®TaqMan 48 Analyzer (Roche) (VD hoặc tương đương).
Bộ lưu điện.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 10 mẫu/lần thực hiện (VD).
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Bông |
Kg |
0,001 |
|
2 |
Dây garô |
Cái |
0,001 |
|
3 |
Cồn |
ml |
1,000 |
|
4 |
Bơm kim tiêm |
Cái |
1,000 |
|
5 |
Panh |
Cái |
0,0001 |
|
6 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
7 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Cái |
0,001 |
|
8 |
Tube đựng bệnh phẩm |
Cái |
3,000 |
|
9 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1,000 |
|
10 |
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng. |
Test |
0,340 |
|
11 |
SPU |
Cái |
1,300 |
|
12 |
Tube-S |
Cái |
1,300 |
|
13 |
Tube-K |
Cái |
1,300 |
|
14 |
Tip-K |
Cái |
1,300 |
|
15 |
Kit CAP-G/CTM Wash Reagent 5.1 L |
test |
1,300 |
|
16 |
Ngoại kiểm (nếu có)* |
|
0,02 |
|
17 |
Đầu côn 1000 µl |
Cái |
1,000 |
|
18 |
Đầu côn có lọc 1000 µl (DNAase- RNAase free) |
Cái |
1,3 00 |
|
19 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
20 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
3,000 |
|
21 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
22 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
23 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
24 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
25 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
26 |
Găng không có bột tal |
Đôi |
0,100 |
|
27 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
28 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
29 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
30 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
31 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10,000 |
|
32 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,010 |
* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) ) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Huyết tương của người bệnh.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (xem phụ lục 3).
Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu (xem phụ lục 6).
Tiến hành kỹ thuật
Bộ sinh phẩm COBAS®Ampliprep/COBAS®TaqMan HBV Test 2.0 (Roche Diagnostics GmbH) (VD).
tách chiết dna vận hành máy cobas ampliprep
(Thực hiện theo quy trình hướng dẫn máy của nhà sản xuất).
huyếch đại dna, đọc kết quả trên máy cobas taqman 48
(Thực hiện theo quy trình hướng dẫn máy của nhà sản xuất).
Nhận định kết quả
Kiểm tra chất lượng
Giá trị định lượng chấp nhận được nếu :
Chứng âm là không phát hiện.
Chứng nội cho giá trị Ct mong đợi.
Không nhận các kết quả của chứng không có giá trị khi xuất hiện thông báo lỗi:
Chứng âm: Invalid (không giá trị).
Chứng dương thấp: Invalid, 1.70E+08 IU/ml, không phát hiện (Target Not Detected).
Chứng dương cao: Invalid, 1.70E+08 IU/ml, không phát hiện (Target Not Detected).
Kết quả và báo cáo
Kết quả định lượng HBV DNA của máy COBAS TaqMan 48 được tính theo đơn vị quốc tế (IU), quy đổi ra số copies/ml theo công thức tính toán của máy đã được thiết lập dựa theo quy chuẩn của WHO.
1IU = 5,82copies
Giá trị tham số Ct (được định nghĩa là số chu kỳ ngưỡng tại đó huỳnh quang vượt ngưỡng cố định, để so sánh với chu kỳ ngưỡng của mẫu chứng chuẩn từ đó suy ra số lượng DNA mẫu đưa vào phản ứng) cho HBV DNA và HBV QS DNA.
Các giá trị chứng của HBV có nồng độ trong giới hạn được thực hiện đồng thời với mẫu bệnh phẩm để thiết lập đường chuẩn, cho thấy mối tương quan giữa giá trị Ct và số log cp/ml.
|
Giá trị trên máy |
Trả lời kết quả |
|
Target Not Detected |
Không phát hiện thấy HBV DNA. |
|
≥ 2.00E + 01IU/ml đến≤1.70E + 08IU/ml |
Nhận những kết quả trong giới hạn này ≥ 116 cp/ml đến ≤ 9.89 x 108 cp/ml. |
|
>1.70E + 08IU/ml |
> 9.89 x 108 cp/ml. |
|
Invalid |
Không giá trị ,chạy lại mẫu bệnh phẩm. |
Những sai sót và xử trí
Việc lấy mẫu máu, vận chuyển và bảo quản không đúng tiêu chuẩn có thể dẫn đến kết quả sai, cho dù phản ứng được thực hiện đúng.
Tham khảo thêm hướng dẫn của nhà sản xuất.
