HCV đo tải lượng Real-time PCR
Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Xác định số lượng bản sao của virus viêm gan C (HCV) trong một đơn vị thể tích máu (copies/ml).
Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý của kỹ thuật Real-time RT-PCR.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
Bộ lưu điện.
Máy ủ nhiệt.
Máy ly tâm dung cho tube 0,2 ml.
Máy ly tâm 25000 x g.
Tủ lạnh 2ºC – 8ºC.
Tủ âm sâu (- 20ºC) hoặc (-70ºC) (nếu có).
Máy vortex.
Tủ an toàn sinh học.
Micropipettes các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao
Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 8 mẫu/lần thực hiện (VD).
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Bông |
Kg |
0,001 |
|
2 |
Dây garô |
Cái |
0,001 |
|
3 |
Cồn |
ml |
1,000 |
|
4 |
Bơm kim tiêm |
Cái |
1,000 |
|
5 |
Panh |
Cái |
0,0001 |
|
6 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
7 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Test |
0,001 |
|
8 |
Tube đựng bệnh phẩm |
Cái |
2,000 |
|
9 |
Găng không có bột tal |
Cái |
0,500 |
|
10 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1,000 |
|
11 |
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng |
Test |
0,400 |
|
12 |
Kít tách ARN |
Test |
1,400 |
|
13 |
cDNA |
Test |
1,400 |
|
14 |
HCV Standard |
Bộ |
0,200 |
|
15 |
Ngoại kiểm (nếu có)* |
|
0,020 |
|
16 |
Ependoff 1,7ml |
Tube |
2,000 |
|
17 |
Ependoff 0,2ml |
Tube |
1,000 |
|
18 |
Đầu côn 10 µl có lọc |
Cái |
1,100 |
|
19 |
Đầu côn 30 µl |
Cái |
1,100 |
|
20 |
Đầu côn 200 µl có lọc |
Cái |
2,200 |
|
21 |
Đầu côn 1 ml có lọc |
Cái |
2,200 |
|
22 |
Ethanol BDH |
ml |
0,250 |
|
23 |
Water-DEPC Treated |
ml |
2,000 |
|
24 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
25 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
26 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
27 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
28 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
29 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
30 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
31 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
32 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
33 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
34 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
35 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10,000 |
|
36 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,010 |
* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Huyết thanh, huyết tương hoặc máu toàn phần.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (xem phụ lục 3)
Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu (xem phụ lục 6).
Tiến hành kỹ thuật:
Bộ sinh phẩm HCV qPCR (VD).
Tách chiết rna
Thực hiện phản ứng rt-pcr
Thực hiện bước này với các tube RT-Mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
Cho chứng +, chứng – hoặc dịch RNA tách chiết vào tube.
Lập chương trình cho máy PCR hoạt động.
Sản phẩm cDNA được dùng để thực hiện phản ứng PCR.
Nếu chưa thực hiện phản ứng PCR ngay, phải bảo quản cDNA ở -20ºC.
Thực hiện phản ứng real-time pcr
Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.
Cho cDNA từ phản ứng RT ở trên vào từng tube HCV qPCR Mix. Sau đó đặt các tube vào máy real-time PCR cùng với 1 bộ standard.
Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình real-time PCR.
Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
Chọn màu “FAM” cho standard. Màu “FAM” và “HEX” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.
Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.
Lưu file dữ liệu vào máy tính.
Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
Nhận định kết quả
Điều kiện của phản ứng
Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM dương tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc âm tính.
Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính.
Phân tích standard
Hệ số tuyến tính (R2) phải nằm trong khoảng 0.960-1.000, tốt nhất 0.9901.000.
Hiệu suất nhân bản (PCR efficiency) phải nằm trong khoảng 90-115%, tốt nhất 95-110%.
Hệ số dốc (Slope) phải nằm trong khoảng -3 đến -4, tốt nhất -3.3 đến -3.6.
Phân tích mẫu
Ngưỡng phát hiện của bộ kit là 3×102 copies/ml.
Những mẫu dương tính chỉ cần chọn màu FAM để phân tích.
Các kết quả dương tính được nhân với hệ số pha loãng sẽ thu được kết quả hàm lượng virus/ml máu (copies/ml), do đó kết quả sau khi nhân:
+ Nếu ≥ 3×102 thì kết luận “Mẫu dương tính: a copies/ml”.
+ Nếu 2 thì kết luận “Mẫu dương tính dưới ngưỡng định lượng”.
Những mẫu âm tính, chứng nội phải dương tính thì mới kết luận mẫu âm tính thật sự.
In đồ thị kết quả.
Những sai sót và xử trí
Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
Nguyên nhân:
Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
Khắc phục
Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.
Trừ những mẫu sự cố, tất cả các mẫu bình thường đều có thể lấy kết quả.
