Nội dung

Hpv real-time pcr

Mục đích và nguyên lý

Mục đích 

Xác định sự có mặt gen đặc trưng của Human papillomavirus (HPV) từ bệnh phẩm đường sinh dục.

Nguyên lý 

Xác định gen đặc trưng của HPV dựa trên nguyên lý của kỹ thuật real-time PCR. 

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị

Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

Bộ lưu điện.

Máy ủ nhiệt.

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml.

Máy ly tâm 25000 x g.

Máy vortex.

Tủ an toàn sinh học cấp 2.

Tủ lạnh 2ºC – 8ºC.

Tủ âm sâu (- 20ºC hoặc -70ºC).

Micropipette các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu/lần.

STT

Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao

Đơn vị

Số lượng

1

Tăm bông vô trùng

Kg

0,001

2

Găng không có bột tal 

Đôi

0,001

3

Khay đựng bệnh phẩm

Cái

0,0001

4

Hộp vận chuyển bệnh phẩm

Cái

0,001

5

Sinh phẩm chẩn đoán

Test

1,000

6

Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng,

kiểm tra chất lượng

Test

1,200

7

Kit tách DNA

Test

2,200

8

Ngoại kiểm (nếu có)*

 

0,020

9

ống Falcol 50 ml

Cái

0,010

10

Eppendorf 1,7 ml

Tube

2,200

11

Eppendorf 0,2 ml

Tube

2,200

12

Đầu côn 10 µl có lọc

Cái

2,200

13

Đầu côn 30 µl

Cái

1,200

14

Đầu côn 200 µl có lọc

Cái

5,200

15

Đầu côn 1 ml có lọc

Cái

3,200

16

Water-DEPC Treated

ml

1,000

17

Giấy thấm

Cuộn

0,100

18

Giấy xét nghiệm

Tờ

2,000

19

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Tờ

0,001

20

Bút viết kính

Cái

0,020

21

Bút bi

Cái

0,010

22

Cái

0,020

23

Khẩu trang

Cái

0,020

24

Găng tay

Đôi

0,100

25

Găng tay xử lý dụng cụ

Đôi

0,020

26

Quần áo bảo hộ

Bộ

0,005

27

Dung dịch nước rửa tay

ml

8,000

28

Cồn sát trùng tay nhanh

ml

1,000

29

Dung dịch khử trùng

ml

10,000

30

Khăn lau tay

Cái

0,010

* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Dịch quệt cổ tử cung, mảnh sinh thiết…  

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: Xem chi tiết phụ lục 3.

Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: Xem chi tiết phụ lục 6.

Tiến hành kỹ thuật:

Bộ sinh phẩm HPV Real-time PCR (VD)

Tách chiết dna

Có thể dùng kit tách chiết DNA bằng hoá chất phenol/chloroform hoặc tách chiết bằng cột của các nhà sản xuất khác như Qiagen, Stratec, Roche…

Thực hiện phản ứng real-time pcr

Thực hiện bước này với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.

Cho chứng +, chứng – hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube HPV rPCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.

Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình realtime PCR. 

Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.

Chọn màu “FAM” và “HEX” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.

Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.

Lưu file dữ liệu vào máy tính.

Cho máy real-time PCR chạy chương trình. 

Nhận định kết quả

Điều kiện của phản ứng 

Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM dương tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính hoặc âm tính.

Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu HEX dương tính.

Phân tích mẫu 

Những mẫu dương tính chỉ cần chọn màu FAM để phân tích, không cần quan tâm đến chứng nội, chứng nội có thể dương hoặc âm. 

Những mẫu âm tính, chứng nội phải dương tính thì mới kết luận mẫu âm tính thật sự.

In đồ thị kết quả

Những sai sót và xử trí

Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự. 

Nguyên nhân

Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế. 

Khắc phục 

Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.

Trừ những mẫu sự cố, tất cả các mẫu bình thường đều có thể lấy kết quả.