Mtb (mycobacterium tuberculosis) định danh tb-lamp

Mục đích và nguyên lý

Mục đích      

Là quy trình phát hiện Mycobacterium tuberculosis complex từ ADN tách chiết của mẫu đờm của Người bệnh có triệu chứng nghi lao.

Nguyên lý

Quy trình dựa trên phản ứng nhân gen đẳng nhiệt, LAMP ( loop- mediated Isothermal Amplication).

Phương pháp LAMP có các đặc tính sau:

Chỉ 1 loại enzyme được sử dụng và phản ứng trong điều kiện đẳng nhiệt

Độ đặc hiệu rất cao do bởi sử dụng 4 đoạn mồi nhận biết 6 vùng riêng biệt trên trình tự đích

Hiệu quả khuếch đại cao cho phép thời gian khuếch đại ngắn

Quy trình tạo ra 1 số lượng lớn sản phẩm nhân gen cho phép phát hiện bằng mắt thường

Các đoạn mồi được thiết kế dựa trên trình tự vùng gyrB và IS của vi khuẩn lao.

Việc phát hiện ADN khuếch đại dựa trên độ đục của phản ứng và được quan sát dưới ánh sáng UV.

Chuẩn bị

Người thực hiện:

Người thực hiện: Người thực hiện đã được đào tạo và có chứng chỉ xét nghiệm .

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp I (nếu có)

Pipét chuyên dụng của Loopamp

Máy vortex

Máy trộn mẫu chuyên dụng của Loopamp

Máy PCR chuyên dụng của Loopamp (LF160)

Tủ lạnh 2-8⁰C

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị
1	Cốc đờm đáy bằng	cái
2	Đầu tip tiệt trùng chuyên dụng Loopamp	ml
3	Đồng hồ	Cái
4	Sinh phẩm chẩn đoán	Test
5	Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm chất lượng	Test
6	Chứng ngoại kiểm dương (nếu có)	μl
7	Ngoại kiểm (nếu có)*
8	Nước cất hai lần	ml
9	Giấy thấm	Cuộn
10	Giấy xét nghiệm	Tờ
11	Sổ lưu kết quả xét nghiệm	Tờ
12	Bút viết kính	Cái
13	Bút bi	Cái
14	Mũ	Cái
15	Khẩu trang	Cái
16	Găng tay latex không bột, tiệt trùng	Cái
17	Găng tay xử lý dụng cụ	Đôi
18	Quần áo bảo hộ	Bộ
19	Dung dịch nước rửa tay	ml
20	Cồn sát trùng tay nhanh	ml
21	Dung dịch khử trùng	ml
22	Khăn lau tay	Cái

*Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Là mẫu đờm nhày mủ , không lẫn máu, còn thức ăn

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Chuẩn bị mẫu & ủ nhiệt

 

Tách chiết ADN

 

Phản ứng LAMP

Chuẩn bị mẫu

Đánh số trên mẫu bệnh phẩm và tuýp ủ nhiệt, mỗi mẻ kèm theo một chứng âm.

Dùng pipét chuyên dụng của hãng cung cấp hút 60 μl đờm hoặc cặn mẫu đờm đã xử lý bằng NALC-NaOH cho vào tuýp ủ nhiệt.

Tiến hành ủ tuýp ủ nhiệt ở 90⁰C (± 5⁰C), trước khi ủ lộn ngược tuýp vài lần. 

Tách chiết adn

Để tuýp ủ nhiệt nguội 3 phút, lộn ngược tuýp 3 lần. 

Lấy nắp tuýp hóa chất tách chiết ra khỏi thân để thẳng đứng vào giá và thay thế bằng tuýp ủ nhiệt, lắc thật mạnh đến tan (I).

Chuẩn bị ống phản ứng LAMP (chuẩn bị đủ số mẫu và 1 chứng âm, 1 chứng dương)

Lắp đầu lọc tách chiết ADN vào (I), bóp mạnh để thu ADN vào tuýp phản ứng LAMP (thể tíchADN nằm trong ngưỡng đánh dấu trên tuýp phản ứng).

Sau mỗi mẫu đóng nắp tuýp, lặp lại với các ống tiếp theo.

Chuyển toàn bộ các mẫu đã chuẩn bị và chứng dương lên máy lắc chuyên dụng trong 2 phút và Spindown mẫu 10 giây.

Phản ứng lamp

Chuyển mẫu vào máy PCR chuyên dụng LAMP, chạy phản ứng trong 40 phút tại 67⁰C (thêm 5 phút cuối   80⁰C).

Nhấc tuýp ra khỏi máy PCR và đặt tuýp vào khay đọc kết quả huỳnh quang.

Bật đèn và so sánh mức độ phát sáng của mẫu với chứng âm và chứng dương.

Ghi chép lại kết quả xét nghiệm.

Vệ sinh khu vực làm việc bằng Hypochlorit sodium 0,5% và làm sạch lại bằng nước cất hoặc cồn 70%.

Diễn giải và báo cáo kết quả

Kiểm tra chất lượng bằng chứng âm và chứng dương.

Chứng âm: Không phát sáng dưới ánh sáng huỳnh quang.

Chứng dương: Phát sáng dưới ánh sáng huỳnh quang.

Tất cả các mẻ xét nghiệm đều thực hiện chứng âm và chứng dương.Chỉ trong trường hợp kết quả hai chứng như mô tả ở trên thì kết quả xét nghiệm các mẫu mới được chấp nhận.

Khi quan sát dưới đèn huỳnh quang: 

Phát quang: Mẫu dương tính: Có vi khuẩn lao.

Không phát quang: Mẫu âm tính: Không có vi khuẩn lao. 

Sai sót và xử trí

Máy báo lỗi khi bệnh phẩm lẫn máu và thức ăn: sàng lọc kĩ bệnh phẩm trước khi làm xét nghiệm.