Mtb (mycobacterium tuberculosis) kháng thuốc betaquiline mic trên môi trường thạch

Mục đích và nguyên lý

Mục đích      

Xác định nồng độ ức chế ức chế tối thiểu (MIC) của Bedaquiline trên môi trường thạch

Nguyên lý

Huyền dịch vi khuẩn được cấy vào môi trường không thuốc và môi trường chứa thuốc kháng sinh theo các nồng độ khác nhau. Xác định môi trường có nồng độ thuốc kháng sinh thấp nhất mà vi khuẩn không mọc, đây chính là nồng độ ức chế tối thiếu (MIC) của thuốc với vi khuẩn.

Chuẩn bị

Người thực hiện:

Người thực hiện: Người thực hiện đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp 2A

Tủ chuẩn bị môi trường (clean bench).

Tủ ấm

Máy   nhiệt.

Tủ lạnh.

Tủ âm sâu.

Máy Vortex

Máy đo độ đục.

Nồi hấp tiệt trùng.

Cân điện tử.

pipet tự động 200ul, 1000ul.

Pipet aid (Thiết bị hỗ trợ hút pipet)

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

	STT		Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao		Đơn vị tính
	1		Bedaquiline		gram
	2		7H11 agar		gram
	3		Glycerol		ml
	4		DMSO		ml
	5		Cồn 700		ml
	6		Nước cất		ml
	7		Presept 2,5		viên
	8		Microshiel		ml
	9		MacFaland số 1, 0.25, 0.5, 4.0		ống
	10		Dung dịch rửa dụng cụ thủy tinh		ml
	11		phoenix ID Brorth		tubes
	12		Tubes nước muối + tween		tubes
	13		Ch ng chuẩn quốc tế H37 Rv		ống
	14		Đĩa Pertri (90mm), chất liệu nhựa Polystyrene.		đĩa
	15		Tuýp 15ml chất liệu nhựa Polystyrene.		Cái
	16		Pipet 5ml chất liệu nhựa Polystyrene.		Cái
	17		Pipet 25ml chất liệu nhựa Polystyrene.		Cái
	18		Túi plastic có khóa		Cái
	19		que cấy nhựa vô trùng		Cái
	20		Đầu côn 200 µl		Cái
	21		Đầu côn 1000 µl		Cái
	22		Eppendorf  1,5 ml		Cái
	23		Tuýp th y tinh trung tính đáy tròn		Cái
	24		Pipette Paster nhựa vô trùng		Cái
	25		Tuýp lưu chủng		Cái
	26		Hộp lưu chủng		Cái
	27		Tuýp thủy tinh trung tính nút xoáy		Cái
	28		Bông thấm nước		gam
	29		Bi thủy tinh 3 mm		viên
30		Túi nilon loại 2 lớp chịu nhiệt hấp		cái
31		Túi rác vàng hủy vật liệu lây nhiễm		cái
32		Thùng rác có nắp		cái
33		Thùng vận chuyển vật liệu lây nhiễm		cái
34		Pipette nhựa 10ml		cai
35		Chai th y tinh trung tính 1000ml		cái
36		Khay   ống cấy		cái
37		Giá cắm tuýp ống cấy		cái
38		Chổi rửa tuýp, dụng cụ		cái
39		Bình cầu 2000ml		cái
40		ống đong 500 ml		cái
41		ống đong 50 ml		cái
42		Cốc có mỏ 500ml		cái
43		Cốc có mỏ 200 ml		cái
44		Khăn lau tay		cái
45		Khẩu trang N95		cái
46		Găng sạch		đôi
47		Găng tay hộ lý		đôi
48		Quần áo bảo hộ		bộ
49		Quần áo công tác		bộ
50		Bút chì		Cái
51		Bút dạ		Cái
52		Bút bi		cái
53		Sổ lưu kết quả xét nghiệm		trang

 

Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm 1 lần /năm từ PXN chuẩn quốc tế 35,000đ/XN)

Bệnh phẩm

Chủng M.tuberculosis thuần tuổi chủng từ 21 ngày đến 28 ngày. 

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

Các bước tiến hành

Chuẩn bị thuốc Bedaquiline (BDQ

Chuẩn bị môi trường đặc 7H11

Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn.

Cấy huyền dịch vi khuẩn vào môi trường đặc 7H11 và ủ ấm

Diễn giải và báo cáo kết quả

Đọc kết quả kháng sinh đồ ở ngày thứ 21.

Bước 1: Kiểm tra kết quả KSĐ của chủng đối chứng H37Rv. Đầu tiên, kiểm tra số lượng khuẩn lạc trên các đĩa môi trường không chứa thuốc kháng sinh, Đạt tiêu chuẩn là 50 khuẩn lạc / đĩa 10^-5, 500 khuẩn lạc / đĩa 10^-4, 5000 khuẩn lạc / đĩa 10^-3. Sau đó, kiểm tra các đĩa môi trường chứa thuốc kháng sinh. Ghi nhận kết quả MIC   đĩa môi trường có nồng độ thuốc thấp nhất mà không có khuẩn lạc mọc. Giá trị MIC c a ch ng H37Rv chấp nhận được trong khoảng 0.015 – 0.12 ug/ml. Nếu giá trị MIC của H37Rv nằm ngoài khoảng trên thì cần thực hiện lại KSĐ.

Bước 2: Kiểm tra kết quả KSĐ của chủng MTB. 

Ghi kết quả vào bảng sau: 

(Ghi số lượng khuẩn lạc đếm được vào cột GC1, GC2, GC3. Đánh dấu X vào cột nồng độ thuốc mà vi khuẩn mọc).

Sai sót và xử trí

Sai sót

Chuẩn bị môi trường không đạt chất lượng

Pha thuốc không đúng nồng độ

Pha huyền dịch vi khuẩn loãng hoặc đặc

Chất lượng kháng sinh: pha không chuẩn, bảo quản sai…

Nhiễm chéo trong quá trình thao tác kỹ thuật.

Thực hành không an toàn.

Xử lý

Giá trị MIC của chủng H37Rv chấp nhận được trong khoảng 0.015 – 0.12 ug/ml. Nếu giá trị MIC c ủa H37Rv nằm ngoài khoảng trên thì cần thực hiện lại KSĐ.

Chú ý: Số lượng khuẩn lạc trong các đĩa môi trường không chứa thuốc kháng sinh đạt tiêu chuẩn là 50 khuẩn lạc / đĩa 10^-5, 500 khuẩn lạc / đĩa 10^-4, 5000 khuẩn lạc / đĩa  10^-3.

Số lượng khuẩn lạc chấp nhận được ở các đĩa môi trường như sau: 10-100 khuẩn lạc/ đĩa 10^-5, 100-1000 khuẩn lạc/ đĩa 10^-4, 100010000 khuẩn lạc/ đĩa 10^-3.

Nếu số lượng khuẩn lạc nằm ngoài khoảng trên, kết quả kháng sinh đồ không đủ tin tưởng, cần thực hiện lại.