Nội dung

Mtb (mycobacterium tuberculosis) kháng thuốc mic trên môi trường lỏng

Mục đích và nguyên lý

Mục đích      

Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của Bedaquiline, và 11 thuốc lao bao gồm nhóm thuốc lao hàng 1 (Isoniazid, Rifampicin và Ethambutol), các thuốc nhóm Fluoroquinolones (Ofloxacin, Levofloxacin và Moxifloxacin), nhóm thuốc tiêm hàng 2 (Amikacin, Kanamycin, Capreomycin) và các thuốc chống lao nhóm 5 (Linezolid, Clofazimine) với Mycobacterium tuberculosis. trên môi trường lỏng

Nguyên lý

Huyền dịch vi khuẩn được cấy vào môi trường không thuốc và môi trường chứa thuốc kháng sinh theo các nồng độ khác nhau. Xác định môi trường có nồng độ thuốc kháng sinh thấp nhất mà vi khuẩn không mọc, đây chính là nồng độ ức chế tối thiếu (MIC) của thuốc với vi khuẩn.

Chuẩn bị

Người thực hiện:

Người thực hiện: Người thực hiện đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp 2A.

Tủ ấm

Tủ lạnh.

Tủ âm sâu.

Máy Vortex

Máy đo độ đục.

Nồi hấp tiệt trùng.

pipet tự động 200ul, 1000ul.

Pipet tự động đa kênh (2-200ul),

Pipet aid (Thiết bị hỗ trợ hút pipet)

Kính đảo ngược chi u ánh sáng.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

 

STT

Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao

Đơn vị tính

 

1

Bộ Kit chuẩn panel 96 giếng

đĩa 

 

2

phoenix ID Brorth

tubes

 

3

Tubes nước muối + tween

tubes

 

4

MacFaland số 1, 

ống

 

4

MacFaland số  0.25

ống

 

4

MacFaland số  0.5

ống

 

4

MacFaland số 4.0

ống

 

6

Cồn 700

ml

 

8

Presept 2,5

viên

 

9

Microshiel

ml

 

11

Dung dịch rửa dụng cụ thủy tinh

ml

 

1

pipet đa kênh

cái

 

2

Đầu côn 200 µl

cái

 

2

Đầu côn 1000 µl

cái

 

3

Pipette nhựa 20ml

cái

 

4

Pipette nhựa 3ml

cái

 

6

Tuýp th y tinh trung tính đáy tròn

cái

 

7

Bi thủy tinh 3 mm

viên

 

8

Tuýp lưu chủng 

cái

 

9

Hộp lưu chủng

cái

 

10

Túi nilon loại 2 lit chịu nhiệt hấp

cái

 

11

Túi rác vàng hủy vật liệu lây nhiễm

cái

 

12

Thùng rác có nắp

cái

 

13

Thùng vận chuyển vật liệu lây nhiễm

cái

 

14

Gía đựng tuýp

cái

 

15

Chổi rửa tuýp, dụng cụ

cái

 

16

Chai th y tinh trung tính 1000ml

cái

 

17

Khăn lau tay

cái

 

18

Găng sạch 

đôi

19

Găng  hộ lý

đôi

 

20

Quần áo bảo hộ 

cái

 

21

Quần áo công tác 

bộ

 

22

Bút chì đen HB

Cái

 

23

Bút dạ

Cái

 

24

Bút bi

cái

 

25

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

trang

 

             

Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm 1 lần /năm từ PXN chuẩn quốc tế 35,000đ/XN)

Bệnh phẩm

Chủng M.tuberculosis thuần, tuổi chủng từ 21 ngày đến 28 ngày. 

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu

Các bước tiến hành

Chuẩn bị đĩa môi trường

Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn.

Cấy huyền dịch vi khuẩn vào đĩa môi trường.

Diễn giải và báo cáo kết quả

Đọc kết quả Kháng sinh đồ ngày thứ 10. Nếu kết quả chưa rõ ràng, đọc kết luận   ngày thứ 14. 

Bước 1: Đặt đĩa môi trường lên kính đảo chiều. Đầu tiên kiểm tra giếng chứng dương, giếng chứng âm, (giếng chứng dương phải có vi khuẩn mọc, giếng chứng âm phải không có vi khuẩn mọc). Sau đó đọc kết quả ở các giếng kháng sinh từ trái qua phải, từ trên xuống dưới. Ghi nhận các giếng có vi khuẩn mọc và tích dấu X vào ô tương ứng trong bảng dưới: (Trong quá trình đọc, so sánh với giếng chứng dương và chứng âm). 

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

A

BDQ

0.008

BDQ

0.015

BDQ

0.03

BDQ

0.06

BDQ

0.12

BDQ

0.25

BDQ

0.5

BDQ

1

BDQ

2

BDQ

4

RIF 0.06

RIF 0.12

B

RIF 0.25

RIF

0.5

RIF

1

RIF

2

RIF

4

INH

0.03

INH

0.06

INH

0.12

INH

0.25

INH

0.5

INH

1

INH

2

C

INH

4

INH

8

INH

16

OFL

0.12

OFL

0.25

OFL

0.5

OFL

1

OFL

2

OFL

4

OFL

8

LEVO

0.12

LEVO

0.25

D

LEVO

0.5

LEVO

1

LEVO

2

LEVO

4

MXF

0.06

MXF

0.12

MXF

0.25

MXF

0.5

MXF

1

MXF

2

MXF

4

KAN

0.12

E

KAN

0.25

KAN

0.5

KAN

1

KAN

2

KAN

4

KAN

8

KAN

16

AMI

0.12

AMI

0.25

AMI

0.5

AMI

1

AMI

2

F

AMI

4

AMI

8

AMI

16

CAP

0.12

CAP

0.25

CAP

0.5

CAP

1

CAP

2

CAP

4

CAP

8

CAP

16

LZD

0.12

G

LZD

0.25

LZD

0.5

LZD

1

LZD

2

LZD

4

LZD

8

CFZ

0.015

CFZ

0.03

CFZ

0.06

CFZ

0.12

CFZ

0.25

POS

H

CFZ

0.5

CFZ

1

CFZ

2

CFZ

4

EMB

0.25

EMB

0.5

EMB

1

EMB

2

EMB

4

EMB

8

EMB

16

NEG

Sơ đồ đọc kết quả kháng sinh đồ trên môi trường lỏng

 Bước 2: Kết luận kết quả MIC của mỗi loại kháng sinh vào file dưới. Ghi nhận kết quả MIC   nồng độ thấp nhất mà vi khuẩn không mọc được. Nếu ở nồng độ thấp nhất mà vi khuẩn không mọc thì ghi nhận kết quả MIC giá trị đó. Nếu   nồng độ cao nhất mà vi khuẩn vẫn còn mọc thì ghi nhận MIC > giá trị đó.

Chú ý: Ví dụ trong dãy nồng độ của Bedaquiline, vi khuẩn mọc ở các giếng có nồng độ kháng sinh 0.008, 0.015, 0.03ug/ml. Giếng 0.06ug/ml vi khuẩn không mọc. Nhưng giếng 0.12ug/ml vi khuẩn lại mọc. Và các giếng tiếp theo 0.25, 0.5, 1, 2ug/ml vi khuẩn không mọc. Hiện tượng này gọi là “bỏ giếng”   0.06ug/ml. Khi đó, ta ghi nhận giá trị MIC là 0.25ug/ml.

Sai sót và xử trí

Sai sót

Pha huyền dịch vi khuẩn loãng hoặc đặc

Bảo quản môi trường không đúng

Nhiễm chéo trong quá trình thao tác kỹ thuật.

Thực hành không an toàn.

Xử lý

Tuân theo nghiêm ngặt quy trình.