Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Phát hiện gene đặc trưng của Mycobacterium tuberculosis trong các loại bệnh phẩm (đờm, dịch phế quản, các loại dịch sinh học, phân hoặc mảnh sinh thiết).
Nguyên lý
Xác định sự có mặt gene đặc trưng của Mycobacterium tuberculosis dựa trên nguyên lý của kỹ thuật Real-time PCR.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
Bộ lưu điện.
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml.
Máy ly tâm 25000 x g.
Máy ủ nhiệt.
Máy vortex.
Tủ lạnh 2°C – 8°C.
Tủ âm sâu (- 20°C) hoặc (-700C) (nếu có).
Micropipettes các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 10 mẫu/lần thực hiện (VD).
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Lọ vô trùng |
Cái |
1.000 |
|
2 |
Bơm kim tiêm 10 ml |
Cái |
1,000 |
|
3 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
4 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Cái |
0,001 |
|
5 |
Găng không có bột tal |
Đôi |
0,020 |
|
6 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1,000 |
|
7 |
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng |
Test |
0,300 |
|
8 |
Kit tách DNA |
Test |
1,300 |
|
9 |
Ngoại kiểm (nếu có)* |
|
0,020 |
|
10 |
Ống Falcol 50ml |
Cái |
1,000 |
|
11 |
Ependoff 1,7ml |
Tube |
2,200 |
|
12 |
Ependoff 0,2ml |
Tube |
2,200 |
|
13 |
Đầu côn 10 µl có lọc |
Cái |
2,200 |
|
14 |
Đầu côn 30 µl |
Cái |
1,200 |
|
15 |
Đầu côn 200 µl có lọc |
Cái |
5,200 |
|
16 |
Đầu côn 1 ml có lọc |
Cái |
3,200 |
|
17 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
18 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
19 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
20 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
21 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
22 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
23 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
24 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
25 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
26 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
27 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
28 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10,000 |
|
29 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,010 |
* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Đờm, dịch phế quản, dịch não tủy, các loại dịch khác, mảnh sinh thiết, phân.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem phụ lục 3).
Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu (Xem phụ lục 6).
Tiến hành kỹ thuật
Bộ sinh phẩm Mycobacterium tuberculosis PCR Kit – GeneProof (VD).
thu nhận và xử lý mẫu.
Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết DNA (nếu cần).
tách chiết dna.
thực hiện phản ứng real-time pcr .
Thực hiện bước này với tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
Chỉ lấy đủ số tube PCR 0,2 ml cần dùng. Phân phối MasterMix vào từng tube.
Cho chứng +, chứng – hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube MasterMix Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.
Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình realtime PCR.
Cài đặt vị trí mẫu và chứng trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
Chọn màu “FAM” và “JOE” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.
Cài đặt chương trình cho máy real-time PCR hoạt động.
Lưu file dữ liệu vào máy tính.
Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
Nhận định kết quả
Điều kiện của phản ứng
Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM tuyến tính vượt quá tín hiệu nền (đường biểu diễn dương tính) và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dương tính hoặc thẳng và không vượt qua tín hiệu nền (đường biểu diễn âm tính).
Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dương tính.
Phân tích mẫu
Mẫu dương tính: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng và bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trước.
Mẫu nghi ngờ: Mẫu có đường biểu diễn dương tính và bắt đầu từ sau chu kỳ 36 → đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm.
Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính.
In đồ thị kết quả
Những sai sót và xử trí
Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
Nguyên nhân
Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
Khắc phục
Pha loãng mẫu từ 10-100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.
Trừ những mẫu sự cố, tất cả các mẫu bình thường đều có thể lấy kết quả.
