Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Phát hiện sự có mặt của gene gyrA (mã hóa cho enzim DNA gyrase) độti bến tạo khả năng đề kháng fluoroquinolones (ofloxaxin và moxifloxacin), gene rRNA 16S (rrs) đột biến tạo khả năng đề kháng của các peptit aminoglycosides/cyclic (các thuốc tiêm capreomycin, viomycin/kanamycin, amikacin), gene embB (mã hóa enzim arabinosyl transferase) đột biến tạo khả năng đề kháng ethambutol của M. tuberculosis.
Nguyên lý
Kỹ thuật Genotype MTBDRsl dựa trên công nghệ LPA (Line Probe Assay) bao gồm kỹ thuật nhân gene (PCR) và gắn kết các đoạn gene sau khi được nhân lên vào màng lai (STRIP) đã gắn sẵn các mẫu dò chuyên biệt (oligonucleotide probes). Mẫu dò cho phép xác định vi khuẩn lao (Mycobacterium tuberculosis complex) có thể liên kết đặc hiệu với các đoạn gene được nhân lên từ các loài thuộc nhóm này.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Tủ thao tác PCR có đèn tím.
Máy ly tâm an toàn (có nắp đậy từng cối) cho tuýp 50ml.
Máy ly tâm lạnh cho tuýp 1.5ml.
Máy ủ nhiệt khô/ướt.
Máy siêu âm (Ultrasonic).
Máy PCR.
Lò vi sóng (Microwave Oven).
Bộ điện di.
Máy lai GT Blot 20.
Tủ lạnh 4oC và tủ lạnh -20°C
Nồi hấp khử trùng.
Tủ sấy.
Máy vortex.
Pipette tự động các loại 10P, 20P, 1000P.
Panh, kẹp (Forceps).
Máy ly tâm mini (Spin down).
Đồng hồ hẹn giờ.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
MTBDRsl |
test |
1,370 |
|
2 |
NALC |
gam |
0,450 |
|
3 |
Nước tinh sạch pha PCR mix |
ml |
0,700 |
|
4 |
NaOH |
gam |
0,650 |
|
5 |
Natri Citrat |
gam |
0,550 |
|
6 |
Thạch điện di |
gam |
0,100 |
|
7 |
TAE x50 |
ml |
0,500 |
|
8 |
Ethidium Bromid |
ml |
0,050 |
|
9 |
Nước cất hai lần (ly tâm – Lai DNA) |
ml |
90,000 |
|
10 |
Tuýp Falcon 50 ml |
tuýp |
1,200 |
|
11 |
Đầu côn 10 µl |
hộp |
0,050 |
|
12 |
Đầu côn 100 µl |
hộp |
0,050 |
|
13 |
Đầu côn 1000 µl |
hộp |
0,070 |
|
14 |
Eppendorf 0,2 ml |
cái |
1,200 |
|
15 |
Eppendorf 1,5 ml |
cái |
2,400 |
|
16 |
Pipette nhựa 5 ml |
cái |
1,200 |
|
17 |
Pipette nhựa 20 ml |
cái |
1,000 |
|
18 |
Găng tay |
đôi |
1,000 |
|
19 |
Khẩu trang N95 |
cái |
1,000 |
|
20 |
Khăn giấy |
cuộn |
0,020 |
|
21 |
Cồn 70° |
ml |
20,000 |
|
22 |
Bút MARKER |
cái |
0,010 |
|
23 |
Bút chì kim 2B |
cái |
0,010 |
|
24 |
Băng dính trong |
cuộn |
0,010 |
|
25 |
Nhãn mã vạch |
Cái |
3,000 |
|
26 |
QC (nếu thực hiện) * |
|
0,1 |
|
27 |
EQAS (nếu thực hiện) * |
|
0,005 |
* Ghi chú:
Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Thực hiện xét nghiệm MTBDRsl chủng vi khuẩn nuôi cấy lao lỏng/đặc.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 2).
Tiến hành kỹ thuật
xử lý mẫu bệnh phẩm.
tách chiết dna.
phản ứng khuếch đại.
lai tự động trên máy gt-blot 20.
Nhận định kết quả
|
STT |
Băng tín hiệu trên thanh STRIP |
Trên phiếu dán thanh STRIP |
Trên phiếu trả kết quả |
|
1 |
Vùng đối chứng CC (AC) xuất hiện tín hiệu. |
|
|
|
1.1 |
TUB không hiện băng. |
Đánh dấu TUB “N” ở cột. |
Không tìm thấy vi khuẩn lao trong mẫu này. |
|
1.2 |
TUB hiện băng. |
Đánh dấu ở cột TUB “P”. |
Tìm thấy vi khuẩn lao trong mẫu. |
|
|
|
|
|
|
1.2.1 |
Các vùng đối chứng của gyrA/rrs/embB không xuất hiện. |
|
Không xác định được có tính kháng fluoroquinolones/ peptit aminoglycosides/cyclic/ ethambutol hay không. |
|
1.2.2 |
Các vùng đối chứng của gyrA/rrs/embB xuất hiện. |
|
|
|
Tất cả các dải bănghoang-dại (WT) đều xuất hiện tín hiệu. |
Đánh dấu ở cột WT của gene tương ứng là “P”. |
|
|
|
Ít nhất 1 trong số các dải băng-hoang-dại (WT) không xuất hiện tín hiệu. |
Đánh dấu ở cột WT của gene tương ứng là “N“. |
|
|
|
Tất cả các băng-đột-biến (MUT) đều không xuất hiện tín hiệu. |
Đánh dấu ở cột MUT của gene tương ứng “N”. |
|
|
|
Ít nhất 1 trong số các băng-đột-biến (MUT) xuất hiện tín hiệu. |
Đánh dấu ở cột MUT của gene tương ứng “P”. |
|
|
|
Ở cột WT của gene tương ứng là “N“ và/hoặc ở cột MUT của gene tương ứng “P”. |
Đánh dấu ở cột resistant của gene tương ứng “+”. |
Kháng thuốc ở gene tương ứng (fluoroquinolones/peptit minoglycosides/cyclic/ ethambutol). |
|
|
Ở cột WT của gene tương ứng là “P “ và ở cột MUT của gene tương ứng “N”. |
Đánh dấu ở cột sensitive của gene tương ứng “+”. |
Nhạy cảm ở gene tương ứng (fluoroquinolones/ peptit aminoglycosides/cyclic/ ethambutol). |
|
|
2 |
Vùng đối chứng CC không xuất hiện tín hiệu. |
|
Không nhận định được kết quả. |
Những sai sót và xử trí
|
Lỗi |
Giải thích |
|
Các băng tín hiệu đều yếu kể cả băng CC |
Kiểm tra thiết bị, hóa chất, nhiệt độ. Nhiệt độ phòng quá thấp hoặc hóa chất không được đưa về đến nhiệt độ phòng. Nhiệt độ ủ quá thấp. Lượng CON-C và/hoặc SUB-C không đủ. Hóa chất hết hạn. |
|
Các băng tín hiệu đều yếu không có, băng CC hoặc trừ. |
Kiểm tra thiết bị, hóa chất, nhiệt độ. PNM và HotstarTaq DNA Polymerase rã đông quá nhiều lần (tối ưu 5-6 lần). PNM, HotstarTaq DNA Polymerase và các thành phần khác của Master Mix bị gia nhiệt. Sử dụng hộp giữ lạnh. Nhiệt độ ủ quá cao hoặc quá thấp. Độ thuần, tinh sạch trong qúa trình xử lý mẫu. Có chất ức chế trong quá trình tách DNA ảnh hưởng đến quá trình nhân gene. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên agarose 2%. Nếu không thấy có sản phẩm PCR thì lặp lại bước tách chiết DNA và PCR; Nếu xuất hiện băng mờ thì tăng lượng mẫu DNA từ 5ml thành 8ml; Nếu các băng sản phẩm PCR nhòe thì pha loãng lượng mẫu DNA. |
|
Các băng được nhuộm mầu không đều |
Thanh Strips không hoàn toàn ngập trong dung dịch lai. Lắc khay có vấn đề trong khi lai. |
|
Mầu nền bị đậm
|
Kiểm tra thiết bị, hóa chất, nhiệt độ. CON-C và/hoặc SUB-C quá đậm đặc. Không đủ dung dịch rửa, bước rửa không sạch. Dung dịch rửa quá lạnh so với nhiệt độ phòng (25°C). Phụ thuộc vào lượng DNA đem lai mà mầu nền có thể đậm hơn. Trong trường hợp này thì ngắt SUB-D ngay khi các băng tín hiệu đã nhìn rõ để tránh bị nhòe băng. |
|
Các yếu tố khác ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm
|
Nhiệt độ ủ sai. Dung dịch lai và nước rửa không được làm ấm và pha trộn trước khi thực hiện. Nhiễm DNA trong bước tách chiết hoặc/và trong hóa chất sử dụng. Trong trường hợp các hóa chất PCR bị nhiễm thì mẫu đối chứng âm cũng xuất hiện băng. Bị nhiễm bởi các giếng bên cạnh trong qua trình bổ sung dung dịch lai. |
