Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Phân nhóm di truyền các chủng M. tuberculosis.
nguyên lý
Phương pháp Spoligotyping (Spacer Oligonucleotide Typing) dựa trên nguyên tắc của phương pháp lai phân tử Southern blot. Các trình tự chuyên biệt trên các chủng Mycobacterium tuberculosis được nhân gene (PCR) và lai với các đoạn nucleotide đặc hiệu.
Trên DNA của các chủng M. tuberculosis có một trình tự bảo tồn đặc biệt chỉ có ở các chủng này được gọi là Direct Repeat (DR), kích thước khoảng 36bp. Giữa các DR này là các spacer kích thước khoảng 35bp đến 41 bp. Có 43 spacer được xác định ở M. tuberculosis. Sự có mặt hoặc thiếu hụt các trình tự này được xác định bằng lai ghép sản phẩm PCR với 43 oligonucleotide tổng hợp từ các trình tự đệm của M. tuberculosis H37Rv. Spoligotyping có thể phân biệt được các chủng thuộc nhóm M. tuberculosis dựa trên sự mất hoặc hiện diện các DR được phân tích, so sánh với dữ liệu spoligotyping quốc tế SpolDB4. Khả năng mất các đoạn DR có thể xảy ra nhiều lần, độc lập ở các chủng, dẫn đến sự tiến hóa, xuất hiện các nhóm spoligotype khác nhau.
Hinh 1. Các vùng DR trên bộ gene M. tuberculosis
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
|
Tủ ATSH cấp II |
Cân điện tử |
|
Máy siêu ly tâm tuýp 1.5ml |
Pipette tự động loại 10, 200, 1000µl. |
|
Máy ly tâm mini (Spin down) |
Panh, kẹp (Forceps |
|
Máy ủ nhiệt khô/ướt |
Tủ sấy |
|
Máy siêu âm (Ultrasonic) |
Nồi hấp khử trùng |
|
Máy nhân gene |
Tủ thao tác PCR |
|
Lò vi sóng (Microwave Oven) |
Đồng hồ hẹn giờ |
|
Bộ điện di |
Hộp giữ lạnh |
|
Máy vortex |
Lò lai DNA |
|
Máy lắc ngang |
Hộp ủ phim X-ray |
|
Tủ lạnh 4o/ – 20o/ -80o |
Hộp rửa phim |
|
Máy đọc gel |
Hệ thống buồng tối tráng phim |
|
Miniblotter |
Hệ thống máy tính |
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
I |
Hóa chất |
|
|
|
1 |
PuReTag PCR Beads |
test |
1,500 |
|
2 |
Dra gắn Biotinylabed 5” |
µl |
0,500 |
|
3 |
Drb |
µl |
0,500 |
|
4 |
Thạch điện di |
gam |
0,100 |
|
5 |
TAE x50 |
ml |
0,500 |
|
6 |
Ethidium Bromid |
ml |
0,050 |
|
7 |
Streptavidin – POD- Conjugate |
ml |
0,500 |
|
8 |
ECL Detection Reagents ( 1 + 2 ) |
ml |
0,500 |
|
9 |
Amersham Hyperfilm ECL ( 18 * 24 cm ) |
Tờ |
0,100 |
|
10 |
Miếng đệm |
Tờ |
0,100 |
|
11 |
SDS |
gam |
0,700 |
|
12 |
Na2HPO4 * 2H2O |
gam |
0,500 |
|
13 |
EDTA |
gam |
0,500 |
|
14 |
NaCl |
gam |
2,500 |
|
15 |
NaOH |
gam |
0,100 |
|
16 |
Tris-HCl |
gam |
0,100 |
|
17 |
Boric Acid |
gam |
0,100 |
|
18 |
Deverlop Film |
ml |
10,000 |
|
19 |
Nước tinh sạch ( pha PCR Mix ) |
ml |
0,500 |
|
20 |
Nước cất hai lần ( pha buffer ) |
lít |
0,500 |
|
II |
Vật tư tiêu hao |
|
|
|
21 |
Đầu côn 10 µl |
cái |
3,000 |
|
22 |
Đầu côn 100 µl |
cái |
4,000 |
|
23 |
Đầu côn 1000 µl |
cái |
3,000 |
|
24 |
Eppendorf 0,2 ml |
cái |
2,000 |
|
25 |
Eppendorf 1,5 ml |
cái |
1,000 |
|
26 |
Găng tay |
đôi |
1,000 |
|
27 |
Khẩu trang N95 |
cái |
1,000 |
|
28 |
Khăn giấy |
cuộn |
0,020 |
|
29 |
Cồn 70° |
ml |
10,000 |
|
30 |
Bút MARKER |
cái |
0,010 |
|
31 |
Bút chì kim 2B |
cái |
0,010 |
|
32 |
QC (nếu thực hiện) * |
|
0,1 |
|
33 |
EQAS (nếu thực hiện) * |
|
0,005 |
* Ghi chú:
Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Thực hiện xét nghiệm phân nhóm M. tuberculosis cho các bệnh phẩm là chủng vi khuẩn lao mọc trên môi trường đặc hoặc lỏng.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 2).
Tiến hành kỹ thuật
lập danh sách, cập nhập thông tin mẫu cần xét nghiệm.
xử lý mẫu theo danh sách đã trích lọc.
tách chiết dna vi khuẩn theo quy trình chuẩn.
thực hiện phản ứng nhân gene.
lai sản phẩm pcr với màng lai biodyne c.
phát hiện tín hiệu lai.
xử lý và phân tích kết quả.
Nhận định kết quả
Tín hiệu lai được thể hiện bằng những ô màu đen. Mỗi chấm đen tương ứng với một đoạn đệm. Phim được đọc từ trái sang phải và từ trên xuống dưới. Hai chủng đầu tiên được sử dụng làm mẫu chứng dương là H37Rv và P3. Một mẫu chứng âm là nước cất giúp kiểm soát các trường hợp dương tính giả, đồng thời kiểm tra sự nhiễm chéo giữa các rãnh lai DNA.
Hinh 2. Kết quả Spoligotyping
Các tín hiệu lai được nhập vào máy tính và xử lý trên phần mềm Bionumeric. Chủng Beijing có kết quả từ vị trí 1-34 là nốt trắng, vị trí số 35 đến 43 là các nốt đen. Các chủng khác cũng sẽ được xác định và nhóm theo từng phân nhóm.
Những sai sót và xử trí
|
Lỗi |
Giải thích và cách Xử lý |
|
Không có tín hiệu lai được phát hiện |
Kiểm tra thiết bị, hóa chất, nhiệt độ. Enzym đã bất hoạt. Chia nhỏ lượng enzym, bảo quản theo đúng điều kiện cần thiết và sử dụng hộp giữ lạnh khi pha mix. Điện di 5µl sản phẩm PCR trên thạch Agarose 2% để kiểm tra quá trình nhân gene có thang DNA hay không. Streptavidin peroxidase bất hoạt hoặc nhiệt độ ủ không đúng. Quá trình biến tính chưa tốt. Hóa chất ủ phim ECL hết hạn. Kiểm tra hoạt tính của màng Biodyne bẳng sản phẩm PCR của các chủng chứng dương. Nếu tín hiệu lai yếu thì nên thay màng mới. Thông thường màng dùng được 8-10 lần. |
|
Hình nền quá đậm |
Kiểm tra các rãnh trên Miniblotter có bị sứt mẻ không. Minibloter không sạch. Ngâm với Extran (Merck) qua đêm và rửa sạch bằng bàn trải mềm chuyên dụng. Vặn chặt các ốc vít trên Minibloter khi lai DNA. Dung dịch, thời gian và nhiệt độ rửa màng không đảm bảo. Nước rửa phim dùng nhiều lần và thời gian ủ phim quá lâu. |
|
Các yếu tố khác ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm
|
Nhiệt độ ủ sai. Dung dịch lai và nước rửa không được ủ ấm trước khi thực hiện. Nhiễm DNA trong bước tách chiết hoặc/và trong hóa chất sử dụng. Trong trường hợp các hóa chất PCR bị nhiễm thì mẫu đối chứng âm cũng xuất hiện băng. Bị nhiễm bởi các rãnh bên cạnh trong qua trình bổ sung mẫu lai DNA. Tín hiệu lai không đều. ECL không được láng đều trên toàn bộ bề mặt của màng lai. Lộ sáng trong quá trình ủ phim. |
