Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Xác định DNA đặc trưng của Mycoplasma pneumoniae.
Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Máy real-time PCR và hệ thống máy vi tính.
Bộ lưu điện.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2ml.
Máy ly tâm 25000 x g.
Tủ lạnh 2°C – 8°C.
Tủ âm sâu (-20°C) hoặc (-70°C) (nếu có).
Máy vortex.
Tủ an toàn sinh học.
Micropipettes các thể tích từ 5 µl – 1000 µl.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 2 mẫu/lần thực hiện (VD).
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Lọ vô trùng |
Cái |
1,000 |
|
2 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
3 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Cái |
0,001 |
|
4 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1,000 |
|
5 |
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng |
Test |
2,000 |
|
6 |
Kit tách DNA |
Test |
3,000 |
|
7 |
EQAS (nếu thực hiện)* |
|
0,005 |
|
8 |
Ống Falcon 50ml |
Cái |
1,000 |
|
9 |
Ependoff 1,7ml |
Tube |
6,000 |
|
10 |
Ependoff 0,2ml |
Tube |
3,000 |
|
11 |
Đầu côn 10 µl có lọc |
Cái |
3,000 |
|
12 |
Đầu côn 30 µl |
Cái |
3,000 |
|
13 |
Đầu côn 200 µl có lọc |
Cái |
3,000 |
|
14 |
Đầu côn 1 ml có lọc |
Cái |
7,000 |
|
15 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
16 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
17 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
18 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
19 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
20 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
21 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
22 |
Găng không có bột tal |
Đôi |
0,100 |
|
23 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
24 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
25 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
| 26 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
27 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10,000 |
|
28 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,010 |
|
29 |
EQAS (nếu thực hiện)* |
|
0,005 |
* Ghi chú:
Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Đờm, dịch phế quản, dịch tỵ hầu.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 3).
Tiến hành kỹ thuật
Bộ sinh phẩm Mycoplasma pneumonia PCR Kit – Gene Proof (VD).
thu nhận và xử lý mẫu
Phải đồng nhất và xử lý mẫu trước khi tách chiết DNA.
tách chiết dna
thực hiện phản ứng real-time pcr
Lấy đủ số tube 0,2 ml cần dùng.
Thực hiện bước này với mastermix và các tube phản ứng được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.
Phân phối MasterMix vào mỗi tube.
Cho chứng [+], chứng [-] hoặc dịch DNA tách chiết vào từng tube MasterMix.
Ly tâm nhẹ cho dịch nằm hết dưới đáy tube. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.
Khởi động máy real-time PCR. Khởi động máy tính và chương trình realtime PCR.
Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.
Chọn màu “FAM” và “JOE” cho mẫu, chứng dương và chứng âm.
Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động.
Lưu file dữ liệu vào máy tính.
Cho máy real-time PCR chạy chương trình.
Nhận định kết quả
Điều kiện của phản ứng
Chứng dương có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM dương tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dương tính hoặc âm tính.
Chứng âm có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu FAM và màu âm tính và đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang màu JOE dương tính.
Phân tích mẫu
Mẫu dương tính: Mẫu có đường biểu diễn dương tính rõ ràng tương ứng với màu của từng tác nhân và bắt đầu từ chu kỳ 36 trở về trước.
Mẫu nghi ngờ: Mẫu có đường biểu diễn dương tính và bắt đầu từ sau chu kỳ 36 → đề nghị lấy mẫu lại để thực hiện xét nghiệm hoặc thực hiện lại xét nghiệm sau 1 – 3 tháng.
Mẫu âm tính: Mẫu có đường biểu diễn âm tính, chứng nội phải dương tính.
In đồ thị kết quả
Những sai sót và xử trí
Có mẫu và chứng nội cũng đều âm tính. Chứng bình thường, có mẫu dương, mẫu âm thật sự.
Nguyên nhân
Có thể mẫu âm thực sự, có thể phản ứng PCR bị ức chế.
Khắc phục
Pha loãng mẫu từ 10 – 100 lần, thực hiện lại toàn bộ thí nghiệm từ bước tách chiết. Sau khi có kết quả phải nhân thêm với hệ số pha loãng mẫu. Nếu vẫn gặp sự cố trên, lấy lại mẫu theo đúng yêu cầu.
Trừ những mẫu sự cố, tất cả các mẫu bình thường đều có thể lấy kết quả.
