Nội dung

Neisseria gonorrhoeae pcr

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Phát hiện sự có mặt bộ gen của Neisseria gonorrhoeae (vi khuẩn lậu) có trong bệnh phẩm. 

Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý thuật PCR. 

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học tối thiểu cấp 1.

Máy ủ nhiệt.

Máy ly tâm 25000 x g.

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml.

Máy vortex.

Máy chạy PCR.

Các loại pipet điều chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl.

Máy điện di.

Máy đọc ảnh gel.

Tủ lạnh thường.

Tủ âm sâu (-20°C) hoặc (-70°C) (nếu có).

Bộ lưu điện.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 2 mẫu/lần thực hiện (VD).

STT

Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao

Đơn vị

Số lượng

1

Giấy xét nghiệm

Tờ

1,000

2

Dụng cụ lấy bệnh phẩm

Que

2,000

3

Găng không có bột (DNase-RNase free)

Đôi

0,500

4

Ống nhựa Ependoff 1.5ml

ống

2,000

5

Bút viết kính, bút bi, diêm

Cái

0,020

6

Xà phòng

Bánh

0,010

7

Khăn lau tay

Cái

0,010

8

Bông, cồn

Túi

0,010

9

Nước muối sinh lý

ml

5,000

10

Bộ KIT chiết tách DNA

Đóng gói 50 phản ứng

Hộp

0,020

11

Khấu hao sinh phẩm cho chứng và QC kiểm

tra lại, standard các loại

Test

1,350

12

PBS Buffer

Đóng gói 500ml

Chai

0,002

13

Absolute Ethanol

Đóng gói 1000ml

Chai

0,002

14

10mM dNTP mix

Đóng gói 100µl

ống

0,005

15

Taq DNA Polymerase, Native

Đóng gói: 5 units/µl, 500 units (100 µl)

ống

0,002

16

Primer đặc hiệu cho vi khuẩn Neisseria gonorrhoeae 

Đóng gói 50nM

bp

0,100

17

UltraPure DNase/RNase Distilled Water

Đóng gói 500ml

Chai

0,001

18

Ultrapure Agarose

Đóng gói 100g

Lọ

0,001

19

Ultrapure TBE Buffer 10X

Đóng gói 1000ml

Chai

0,001

20

100bp DNA ladder

Đóng gói 50µg

ống

0,001

21

10X BlueJuice Gel Loading dye

Đóng gói 3x1ml

ống

0,001

22

Utrapure 10mg/ml Ethidium Bromide

Đóng gói 10ml

lọ

0,001

23

ống ly tâm 1,7ml

Đóng gói 500c/túi

túi

0,004

24

ống PCR 0,2 ml, nắp phẳng

Đóng gói: 500c/túi, 1000c/hộp

hộp

0,001

25

Đầu côn 1000ml có lọc

túi

0,001

26

Đầu côn 200ml có lọc

túi

0,004

27

Đầu côn  0,2-10µl có lọc

túi

0,001

28

Dung dịch khử trùng

ml

1,000

29

Sổ lưu kết quả xét nghiệm

Quyển

0,001

30

Khay đựng bệnh phẩm

Cái

0,0001

31

Hộp lưu bệnh phẩm

Cái

0,0001

32

Quần áo bảo hộ

Bộ

0,005

33

Cái

0,020

34

Khẩu trang

Cái

0,020

35

Găng tay xử lý dụng cụ

Đôi

0,020

36

Giấy thấm

Cuộn

0,100

37

EQAS (nếu thực hiện)*

 

0,005

* Ghi chú: 

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Các loại dịch tiết và mô sinh thiết.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 3).

Tiến hành kỹ thuật

Tách chiết DNA từ bệnh phẩm.

Pha hỗn hợp phản ứng PCR.

Chạy phản ứng PCR.

Điện di sản phẩm PCR.

Đọc kết quả.

Nhận định kết quả

Phản ứng dương tính: Có vạch sản phẩm PCR tương ứng với cặp mồi.

Phản ứng âm tính: Không có vạch sản phẩm PCR tương ứng với cặp mồi.

Những sai sót và xử trí

Sai sót

Phản ứng dương tính giả: Do tạp nhiễm từ môi trường.

Phản ứng âm tính giả: Do phản ứng PCR bị ức chế.

Xử trí

Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân thủ chặt chẽ quy trình kỹ thuật.