Neisseria gonorrhoreae real-time pcr

Mục đích và nguyên lý

Mục đích:

Xác định sự có mặt của Neisseria gonorrhoeae trong bệnh phẩm dịch niệu đạo, cổ tử cung hoặc dịch cơ thể có nghi ngờ có căn nguyên N. gonorrhoeae.

Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học và chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp 2

Máy ủ nhiệt

Máy ly tâm > 12000 gpm/phút 

Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml

Máy vortex

Máy Real-time PCR 

Ống Eppendorf 1,5 ml ho c 2 ml

Các loại Micropipette đi u chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl

Đầu côn có màng lọc 10 μl, 100 μl, 200 μl và 1000 μl

Tủ lạnh thường

Tủ âm sâu (20⁰C) hoặc (-70⁰C) (nếu có)

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

STT		Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao		Đơn vị
1		Dụng cụ lấy bệnh phẩm		Cái
2		Khay đựng bệnh phẩm		Cái
	STT		Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao		Đơn vị
	3		Hộp vận chuyển bệnh phẩm		Cái
	4		Găng không có bột (DNase-RNase free)		Đôi
	5		Ống nhựa Ependoff 1.5ml		ống
	6		Sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chẩn đoán		Test
	7		Khấu hao sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng		Test
	8		Hóa chất và vật tư tiêu hao cho tách acid nucleic		Test
	9		Tube eppendorff 1,5 ml		Cái
	10		Strip 8 tubes 0,1 ml		Cái
	11		Nắp đậy strip 8 tubes		Cái
	12		Đầu côn có phin lọc 1 ml		Cái
	13		Đầu côn có phin lọc 200 µl		Cái
	14		Đầu côn có phin lọc 10 µl		Cái
	15		Giấy thấm không bụi		Cuộn
	16		Giấy xét nghiệm		Tờ
	17		Sổ lưu kết quả xét nghiệm		Tờ
	18		Bút viết kính		Cái
	19		Bút bi		Cái
	20		Mũ		Cái
	21		Khẩu trang		Cái
	22		Găng tay xử lý dụng cụ		Đôi
	23		Quần áo bảo hộ		Bộ
	24		Dung dịch xà phòng rửa tay		ml
	25		Cồn sát trùng tay nhanh		ml
	26		Dung dịch khử trùng		ml
	27		Khăn lau tay		Cái
	28		Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*

Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Dịch niệu đạo, cổ tử cung ho c dịch cơ thể có nghi ngờ có căn nguyên N.

gonorrhoeae.

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem phụ lục). 

Tiến hành kỹ thuật

VD bộ sinh phẩm chẩn đoán LightPower CHT/NGN rPCR Plus (hoặc sinh phẩm tương đương)

Tách chiết DNA theo hướng dẫn sử dụng của Kit tách chiết DNA. 

Thực hiện phản ứng Real-time PCR.

Đọc kết quả

Nhận định kết quả

Bước 1: kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm

Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu không bị ngoại nhiễm. Vì vậy có thể đọc kết quả mẫu chứng (+) và mẫu.

Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu bị ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết DNA lại.

Bước 2: kiểm tra độ nhạy

Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX

Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu HEX: PCR không bị ức chế.

Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại hoặc tín hiệu thấp với kênh màu HEX, PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, tách chiết DNA lại hoặc pha loãng DNA trước khi chạy PCR.

Bước 3: xác định mẫu dương tính neisseria gonorrhoeae

Chọn từng mẫu , chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM

Mẫu có tín hiệu huỳnh quang với kênh màu FAM và có Ct: là những mẫu dương tính Neisseria gonorrhoeae

Các mẫu có Ct

pha loãng DNA mẫu với tỉ lệ 1/5 trước khi cho vào PCR master mix

Bước 4: xác định mẫu âm tính neisseria gonorrhoeae

Chọn từng mẫu, chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và

HEX

Mẫu không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và dương tính với màu HEX, thì kết quả là mẫu âm tính với Neisseria gonorrhoeae

Nếu mẫu có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM nhưng không có Ct và dương tính với màu HEX, thì kết quả là Neisseria gonorrhoeae trong bệnh phẩm dưới ngưỡng phát hiện

Nếu mẫu không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và âm tính với màu HEX, thì mẫu bị ức chế cần tiến hành lại PCR với DNA đã pha loãng hoặc tách chiết lại. Nếu kết quả vẫn như cũ thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm.

Những sai sót và xử trí

Phản ứng dương tính giả: do tạp nhiễm từ môi trường

Phản ứng âm tính giả: do phản ứng PCR bị ức chế

Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân thủ chặt chẽ quy trình kỹ thuật.