Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Phát hiện các Mycobacteria không phải Mycobacterium tuberculosis bằng kỹ thuật nuôi cấy môi trường đặc.
Nguyên lý
Xác định Mycobacterum tuberculosis có trong bệnh phẩm dựa vào hình ảnh khuẩn lạc mọc trên môi trường đặc và được xác định khi các thử nghiệm khẳng định MTB cho kết quả âm tính.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Máy li tâm đủ tiêu chuẩn an toàn sinh học, đủ lực li tâm (>= 3000g).
Máy lắc.
Tủ lạnh.
Cân.
Đồng hồ phút.
Kính hiển vi.
Nồi hấp.
Tủ ấm hoặc buồng ấm (35 – 38°C).
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
I |
Hoá chất |
|
|
|
1 |
KH2PO4 |
gam |
0,300 |
|
2 |
MgSO4 |
gam |
0,0033 |
|
3 |
MgCitrat |
gam |
0,0084 |
|
4 |
Asparagin |
gam |
0,051 |
|
5 |
Glyxerol |
ml |
0,168 |
|
6 |
Malachite |
gam |
0,0026 |
|
7 |
Na2HPO4 |
gam |
0,250 |
|
8 |
Trứng gà |
quả |
1/3 |
|
9 |
Cồn 70° |
ml |
150,000 |
|
10 |
Nước cất |
ml |
65,000 |
|
11 |
NaOH |
gam |
0,020 |
|
12 |
NaCitrat |
gam |
0,015 |
|
13 |
NALC |
mg |
25,000 |
|
14 |
Dầu soi |
ml |
0,050 |
|
15 |
Cồn 95° |
ml |
4,500 |
|
16 |
Cacbol fuchsin |
gam |
0,015 |
|
17 |
HCL |
ml |
0,150 |
|
18 |
Phenol |
ml |
0,250 |
|
19 |
Methylen |
gam |
0,015 |
|
20 |
Thanh định danh Niacin |
test |
0,400 |
|
21 |
Presept 2,5 |
viên |
0,050 |
|
22 |
Microshiel |
ml |
1,000 |
|
II |
Vật tư tiêu hao |
|
|
|
23 |
Tuyp nắp xoáy vô trùng 50ml |
cái |
1,100 |
|
24 |
Lam kính |
cái |
1,200 |
|
25 |
Pipette Paster nhựa vô trùng |
cái |
2,000 |
|
26 |
Que phết đờm |
cái |
0,500 |
|
27 |
Giấy lau kính hiển vi |
tờ |
0,100 |
|
28 |
Gạc lọc |
mét |
0,030 |
|
29 |
Bông thấm nước |
gam |
0,500 |
|
30 |
Bông mỡ |
gam |
0,500 |
|
31 |
Pipette nhựa 10ml |
cái |
0,200 |
|
32 |
Đầu côn nhựa loại 1ml |
cái |
0,010 |
|
33 |
Găng tay |
đôi |
0,200 |
|
34 |
Tuýp thủy tinh trung tính nút xoáy |
cái |
0,300 |
|
35 |
Tuýp 18 x 24 mm |
cái |
0,100 |
|
36 |
Bô can |
cái |
0,010 |
|
37 |
Bình cầu 2000ml |
cái |
0,001 |
|
38 |
ống đong 500 ml |
cái |
0,001 |
|
39 |
ống đong 50 ml |
cái |
0,001 |
|
40 |
Phễu thuỷ tinh 500ml |
cái |
0,001 |
|
41 |
Cốc mỏ 500ml |
cái |
0,001 |
|
42 |
Cốc có mỏ 200 ml |
cái |
0,001 |
|
43 |
Chai thủy tinh trung tính 1000ml |
cái |
0,002 |
|
44 |
Hộp đựng tiêu bản |
cái |
0,001 |
|
45 |
Túi nilon loại 2 lớp chịu nhiệt hấp |
cái |
0,050 |
|
46 |
Túi rác vàng hủy vật liệu lây nhiễm |
cái |
0,020 |
|
47 |
Thùng rác có nắp |
cái |
0,001 |
|
48 |
Thùng vận chuyển vật liệu lây nhiễm |
cái |
0,001 |
|
49 |
Hộp đựng vật sắc nhọn |
cái |
0,003 |
|
50 |
Khay đựng bệnh phẩm |
cái |
0,001 |
|
51 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
cái |
0,001 |
|
52 |
Giá đựng tuýp |
cái |
0,001 |
|
53 |
Khay đựng môi trường |
cái |
0,001 |
|
54 |
Mũ |
cái |
0,020 |
|
55 |
Khẩu trang |
cái |
0,020 |
|
56 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
57 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,001 |
|
58 |
Dung dịch tẩy rửa dụng cụ |
ml |
10,000 |
|
59 |
Bút chì đen HB |
cái |
0,020 |
|
60 |
Bút bi |
cái |
0,010 |
|
61 |
Bật lửa |
cái |
0,010 |
|
62 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
63 |
Khăn lau tay |
cái |
0,005 |
|
64 |
Giấy trả kết quả xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
65 |
Nhãn mã vạch |
cái |
4,000 |
|
66 |
QC (nếu thực hiện) * |
|
0,1 |
|
67 |
EQAS (nếu thực hiện) * |
|
0,005 |
* Ghi chú:
Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Đờm, dịch phế quản, phân, mủ, dịch não tủy, các loại dịch khác…
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 1 và Phụ lục 4).
Tiến hành kỹ thuật
chuẩn bị môi trường hóa chất.
xử lý bệnh phẩm,nhuộm soi, nuôi cấy.
định danh.
xử lý vật liệu lây nhiễm.
Nhận định kết quả
Kết quả nhuộm soi
AFB có hình ảnh trực khuẩn mảnh, hơi cong, bắt màu đỏ đứng riêng lẻ hay xếp đôi hoặc từng đám trên nền xanh.
Đếm số lượng AFB và ghi kết quả như bảng sau:
|
Số lượng AFB |
Kết quả |
Phân loại |
|
Có > 10 AFB/ 1 vi trường (Soi ít nhất 20 vi trường) |
Dương tính
|
AFB 3 (+) |
|
Có từ 1-10 AFB/ 1 vi trường (Soi ít nhất 50 vi trường) |
Dương tính
|
AFB 2 (+) |
|
Có từ 10-99 AFB/ 100 vi trường |
Dương tính |
AFB 1 (+) |
|
Có từ 1-9 AFB/ 100 vi trường |
Dương tính |
Ghi số lượng AFB/100 vi trường |
|
Không AFB/ 100 vi trường |
Âm tính |
|
Kết quả cấy
Kiểm tra nhiễm trùng: sau 24 – 48 giờ.
Kiểm tra sau 72 giờ: mặt môi trường khô, xoáy nắp tuýp tránh bay hơi làm khô môi trường.
Theo dõi trong vòng 7 ngày để phát hiện chủng Mycobacteria mọc nhanh.
Đọc kết quả cấy hàng tuần đến 8 tuần.
Khuẩn lạc nhóm Mycobacteria không phải lao (NTM) dạng S trơn bóng, nhày, có hoặc không sắc tố, có thể mọc nhanh trong vòng 7 ngày.
Quy định đánh giá kết quả
|
Đọc kết quả cấy |
Nhận định kết quả cấy |
|
|
Không thấy khuẩn lạc. |
Âm tính |
|
|
1 – 19 khuẩn lạc. |
Dương tính: số khuẩn lạc |
|
|
20 – 100 khuẩn lạc (ước tính khuẩn lạc mọc 1/3 bề mặt môi trường). |
Dương tính: 1 + |
|
|
100 – 200 khuẩn lạc (ước tính khuẩn lạc mọc ½ bề mặt môi trường). |
Dương tính: 2 + |
|
|
200 – 500 khuẩn lạc |
Dương tính: 3 + |
|
|
(ước tính khuẩn lạc mọc 2/3 bề mặt môi trường). |
|
|
|
> 500 khuẩn lạc (ước tính khuẩn lạc phủ kín toàn bộ bề mặt môi trường). |
Dương tính: 4 + |
|
|
Nhiễm vi khuẩn hoặc nấm. |
Ngoại nhiễm |
|
Phân biệt ntm với mtb
NTM (Mycobacteria không phải lao): Niacin âm tính.
NTM: Thử nghiệm TBcID cho kết quả âm tính.
Những sai sót và xử trí
Tỉ lệ soi âm cấy dương thấp: Có thể do khử tạp quá mạnh (nồng độ hóa chất, thời gian tiếp xúc) làm chết NTM (NTM nhạy cảm với khử tạp hơn so với MTB).
Tỉ lệ ngoại nhiễm cao: Có thể tăng thể tích hoặc nồng độ hóa chất, không kéo dài thời gian khử nhiễm.
Nhiễm chéo có thể xảy ra, đề phòng nhiễm chéo: Mỗi mẻ chỉ xử lý 6 – 8 bệnh phẩm không mở đồng thời các tuýp mẫu. Chia nhỏ lượng dung dịch khử nhiễm và dung dịch đệm, không chắt trực tiếp dung dịch khử nhiễm hay dung dịch đệm vào bệnh phẩm.
