Ntm (non tuberculosis mycobacteria) nuôi cấy môi trường lỏng

Mục đích và nguyên lý

Mục đích 

Phát hiện các Mycobacteria không phải là Mycobacterium tuberculosis bằng kỹ thuật nuôi cấy môi trường lỏng.

Nguyên lý

Tube MGIT chứa môi trường lỏng Middlebrook 7H9 có oxy hòa tan và 1 hợp chất gồm: chất màu huỳnh quang, tris 4, 7-diphenyl-1, 10-phenonthroline ruthenium chloride pentahydrate được gắn vào lớp silicone ở đáy tube. Khi vi khuẩn phát triển oxy bị tiêu thụ, nồng độ oxy giảm, chất màu huỳnh quang thoát ức chế sẽ phát quang trong tube MGIT, có thể quan sát bằng tia UV. Cường độ phát quang tương ứng với mức độ tiêu thụ oxy, tương ứng nồng độ vi khuẩn phát triển trong tube môi trường. Máy tự động giám sát sự phát quang 60 phút một lần. Vi khuẩn mọc càng nhiều càng tăng độ phát quang. Vi khuẩn mọc sẽ được định danh để xác định các Mycobacteria khác không phải là Mycobacterium tuberculosis.

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.

Phương tiện, hóa chất

Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp 2. 

Máy li tâm đủ tiêu chuẩn an toàn sinh học, đủ lực li tâm (>= 3000g). 

Máy lắc.

Tủ lạnh.

Cân.

Đồng hồ phút.

Kính hiển vi. 

Nồi hấp. 

Hệ thống máy BACTEC- MGIT 960 hoặc 320.

Pipet tự động loại 100-1000 µl.

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị	Số lượng
I	Hoá chất
1	MGIT tuýp loại 7 ml	tuýp	1,100
2	MGIT supplement – PANTA	ml	0,900
3	KH2PO4	gam	0,250
4	Na2HPO4	gam	0,250
5	Cồn 70º	ml	5,000
6	Nước cất	ml	60,000
7	NaOH	gam	0,020
8	NaCitrat	gam	0,015
9	NALC	mg	25,000
10	Dầu soi	ml	0,100
11	Cồn 95º	ml	4,500
12	Cacbol Fuchsin	gam	0,030
13	HCL	ml	0,300
14	Phenol	ml	0,500
15	Methylen	gam	0,030
16	Thanh định danh nhanh ( SD, TBcID..)	test	0,400
17	Presept 2,5	viên	0,050
18	Microshiel	ml	1,000
19	Lòng trắng trứng	ml	0,010
II	Vật tư tiêu hao
20	Lam kính	cái	2,200
21	Tuyp nắp xoáy vô trùng 50ml	cái	1,100
22	Pipette Paster nhựa vô trùng	cái	3,000
23	Chai thủy tinh trung tính 1000ml	cái	0,001
24	Que phết đờm	cái	0,500
25	Giấy lau kính hiển vi	tờ	0,100
26	Bông thấm nước	gam	0,500
27	Đầu côn nhựa loại  1ml	cái	0,010
28	Găng tay	đôi	0,200
29	Tuýp 18 x 24 mm	cái	0,100
30	Bô can	cái	0,010
31	Hộp đựng tiêu bản	cái	0,001
32	Túi nilon loại 2 lớp chịu nhiệt hấp	cái	0,050
33	Túi rác vàng hủy vật liệu lây nhiễm	cái	0,020
34	Thùng rác có nắp	cái	0,001
35	Thùng vận chuyển vật liệu lây nhiễm	cái	0,001
36	Hộp đựng vật sắc nhọn	cái	0,003
37	Khay đựng bệnh phẩm	cái	0,001
38	Hộp vận chuyển bệnh phẩm	cái	0,001
39	Giá đựng tuýp	cái	0,001
40	Mũ	cái	0,020
41	Khẩu trang	cái	0,020
42	Găng tay xử lý dụng cụ	Đôi	0,020
43	Quần áo bảo hộ	Bộ	0,001
44	Dung dịch tẩy rửa dụng cụ	ml	10,000
45	Bút chì đen HB	cái	0,020
46	Bút bi	cái	0,010
47	Bật lửa	cái	0,010
48	Sổ lưu kết quả xét nghiệm	Tờ	0,001
49	Khăn lau tay	cái	0,005
50	Giấy trả kết quả xét nghiệm	Tờ	2,000
51	Nhãn mã vạch	cái	3,000
52	QC (nếu thực hiện) *		0,1
53	EQAS (nếu thực hiện) *		0,005

* Ghi chú: 

Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Đờm, dịch phế quản, phân, mủ, dịch não tủy, các loại dịch khác, …

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu yêu cầu.

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 1 và Phụ lục 4).

Tiến hành kỹ thuật

chuẩn bị môi trường hóa chất.

xử lý bệnh phẩm, nhuộm soi, nuôi cấy. 

định danh: soi định danh và định danh nhanh sắc ký miễn dịch.

xử lý vật liệu lây nhiễm.

Nhận định kết quả

Kết quả nhuộm soi:

Số lượng AFB	Kết quả	Phân loại
Có > 10 AFB/1 vi trường (Soi ít nhất 20 vi trường)	Dương tính	AFB 3 (+)
Có từ 1 – 10  AFB/1 vi trường (Soi ít nhất 50 vi trường)	Dương tính	AFB 2 (+)
Có từ 10 – 99 AFB/100 vi trường	Dương tính	AFB 1 (+)
Có từ 1 – 9 AFB/100 vi trường	Dương tính	Ghi số lượng AFB/100 vi trường
Không AFB/100 vi trường	Âm tính

Kết quả cấy

Máy báo tự động mỗi giờ, kết quả dương tính trung bình trong vòng 3 ngày đến 2 tuần.

Kết quả cấy âm tính máy báo sau 6 tuần.

Ngoài ra tuýp cấy máy báo âm tính có đầu vào nhuộm soi dương phải ly tâm lấy cặn nhuộm soi, các tuýp máy báo âm phải quan sát bằng mắt thường phát hiện cặn vụn trước khi hủy.

Kết quả định danh

soi định danh (phân biệt ntm với mtb)

NTM (Mycobacteria không phải lao) soi định danh không thấy cuộn thừng, AFB vụn thành đám.

định danh nhanh bằng sắc ký (sd, tbcid…)(phân biệt ntm với mtb)

NTM (Mycobacteria không phải lao) âm tính (có 1 vạch màu tại vị trí “C”).

Những sai sót và xử trí

Nhiễm chéo trong quá trình thao tác kỹ thuật: Hạn chế nhiễm chéo bằng cách phân loại nguồn bệnh phẩm dịch, đờm, nghi MDR, người bệnh thường… để Xử lý thích hợp. Không cấy chuyển chủng không làm tiêu bản soi định danh cùng lúc Xử lý bệnh phẩm. Chia nhỏ hóa chất dung dịch đệm, thao tác nhẹ nhàng tránh tạo hạt mù, chắt dung dịch vào thành tuýp. Không mở đồng thời các tuýp mẫu Mỗi mẻ Xử lý 6 – 8 mẫu.

Tỷ lệ ngoại nhiễm cao: Giảm ngoại nhiễm bằng cách Xử lý mẫu càng sớm càng tốt. Mẫu bảo quản 2 – 8ºC không quá 72 giờ, dịch dạ dày, nước tiểu Xử lý sớm trước 4 giờ kể từ khi lấy mẫu. Tuân thủ quy trình xử lý, nồng độ và thời gian tiếp xúc với hóa chất. Đảm bảo chất lượng môi trường, sinh phẩm, hóa chất, dụng cụ trong hạn và vô trùng. 

Nhầm lẫn hành chính: Kiểm tra cẩn thận về hành chính từ khâu nhận bệnh phẩm, vào sổ, trả kết quả, tránh nhầm lẫn. Khi thao tác kỹ thuật xếp mẫu theo thứ tự, tuân thủ qui tắc để cách ô trống đầu tiên.