Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Phát hiện Pneumocystis jirovecii có trong bệnh phẩm.
Nguyên lý
Phát hiện Pneumocystis jirovecii bằng kỹ thuật nhuộm bạc dựa vào hình thể, kích thước, cấu tạo.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh – Ký sinh trùng.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh – Ký sinh trùng.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Bộ thuốc nhuộm Bạc bao gồm: Dung dịch acid Chromic hoặc acid Perioric; Dung dịch nhuộm Bạc; Dung dịch Gold clorid 0,1%; Dung dịch Bouins; Dung dịch Thiosunphat; Dung dịch Chromotrope 5%.
Nước cân bằng.
Trang thiết bị
Kính hiển vi quang học.
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Máy lắc.
Máy ly tâm 3000 vòng/phút.
Tủ ấm 60-70 độ C.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1. |
Lọ lấy bệnh phẩm |
Lọ |
1,000 |
|
2. |
Lam kính |
Cái |
2,000 |
|
3. |
Lam kinh kiểm chuẩn |
Cái |
0,200 |
|
4. |
Dầu kính |
ml |
1,000 |
|
5. |
Xylen lau kính |
ml |
1,000 |
|
6. |
Dung dịch NaCl 0,9% |
ml |
1,000 |
|
7. |
Cồn 90 độ (vệ sinh dụng cụ) |
ml |
10,000 |
|
8. |
Que cấy |
cái |
1,000 |
|
9. |
Đèn cồn |
Cái |
0,0001 |
|
10. |
Bộ thuốc nhuộm Bạc |
ml |
1,000 |
|
11. |
Dung dịch đệm |
ml |
10,000 |
|
12. |
Que cấy |
Cái |
1,000 |
|
13. |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
14. |
Ống nghiệm thủy tinh |
Ống |
1,000 |
|
15. |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
16. |
Bông |
kg |
0,001 |
|
17. |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
18. |
Găng tay |
Đôi |
3,000 |
|
19. |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
20. |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,001 |
|
21. |
Axít ngâm lam |
ml |
10,000 |
|
22. |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
23. |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
24. |
Bật lửa |
Cái |
0,010 |
|
25. |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
26. |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
2,000 |
|
27. |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
28. |
Khăn lau tay |
Cái |
0,030 |
|
29. |
Giấy trả kết quả xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
Bệnh phẩm
Đờm, dịch rửa phế quản, phế nang, hoặc sinh thiết phổi.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Lấy bệnh phẩm
Đờm, dịch rửa phế quản, phế nang, hoặc sinh thiết phổi.
Nếu bệnh phẩm là dịch hoặc đờm thì lấy 2-5ml.
Tiến hành kỹ thuật
chuẩn bị bệnh phẩm: xử lý bệnh phẩm
Đối với dịch rửa phế quản, dịch màng phổi: Lấy khoảng 2 ml vào ống thủy tinh ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút x 10 phút, lấy cặn.
Đối với bệnh phẩm đờm: Lấy khoảng 1ml đờm, cho thêm 1 ml nước muối sinh lý 0.9%, làm tan đờm bằng máy lắc hoặc đũa lắc thủy tinh sau đó ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút x 10 phút, lấy cặn.
làm tiêu bản
Dùng que cấy lấy bệnh phẩm đã ly tâm lấy cặn dàn tiêu bản lên lam kính (đường kính từ 1 – 1,5 cm) và để khô tự nhiên.
các bước nhuộm
Ngâm lam trong dung dịch acid Chromic hoặc acid Perioric – 1 giờ, rồi rửa nước.
Ngâm trong dung dịch nhuộm Bạc – 1 giờ, rồi rửa nước.
Ngâm trong dung dịch Gold clorid 0,1% – 1 phút, rửa nước.
Ngâm trong dung dịch Bouins – 5 phút, rửa nước.
Ngâm trong dung dịch Thiosunphat – 2 phút, rửa nước.
Ngâm trong dung dịch Chromotrope 5% – 15 phút, rửa nước.
Để khô tự nhiên và soi vật kính dầu với vật kính 100X.
Nhận định kết quả
Có 4 hình thể khác nhau
Thể hoạt động dạng nhỏ (đơn bội): Có hình quả trứng hoặc hình lưỡi liềm, kích thước 1-3 µm, có một nhân ở giữa, tế bào chất đậm đặc.
Thể hoạt động dạng lớn (lưỡng bội): Có hình thể không đều, kích thước > 4 – 10 µm, có một nhân và tế bào chất loãng hơn.
Thể tiền bào nang: Hình quả trứng, kích thước 3,5 – 5,5 µm, thành ngoài rất dầy, thường nhẵn và đều, nhân chia nhiều mảnh (2 – 8 mảnh).
Thể bào nang: Hình tròn, kích thước 4 – 8 µm, thành bào nang tiếp tục dày thêm, bên trong có 8 ký sinh trùng non hoàn chỉnh. Mỗi ký sinh trùng con có một nhân, tế bào chất và một màng mỏng bao quanh. Các thể trong bào nang có hình tròn, quả chuối, hoặc dạng amíp.
Những sai sót và xử trí
Sai sót
Bệnh phẩm dịch lấy không đúng kỹ thuật, mảnh sinh thiết không đúng chỗ bị tổn thương, bệnh phẩm đờm lấy không đúng kỹ thuật (chỉ có nước bọt), đờm không qua xử lý làm tan sẽ không ly tâm lấy cặn được.
Xử trí
Lấy bệnh phẩm và thao tác đúng kỹ thuật.
