Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Xác định sự có mặt gen đặc trưng của RSV (Respiratory syncytial virus) trong huyết thanh hoặc huyết tương.
Nguyên lý
Sử dụng cặp mồi đặc hiệu để xác định sự có mặt gen đặc trưng của RSV (Respiratory syncytial virus) bằng kỹ thuật Real-time RT – PCR.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Máy Real-time PCR và hệ thống máy tính.
Bộ lưu điện.
Máy ly tâm 25000 x g.
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml.
Máy ủ nhiệt.
Máy vortex.
Tủ lạnh 2ºC – 8ºC.
Tủ âm sâu (-20ºC hoặc -70ºC).
Micropipette.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Thực hiện xét nghiệm 02 mẫu/lần.
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Bông |
kg |
0,001 |
|
2 |
Cồn |
ml |
1,000 |
|
3 |
Bơm kim tiêm |
Cái |
1,000 |
|
4 |
Panh |
Cái |
0,0001 |
|
5 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
6 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Test |
0,001 |
|
7 |
Tube đựng bệnh phẩm |
Cái |
2,000 |
|
8 |
Găng không có bột (DNase-RNase free) |
Cái |
0,500 |
|
9 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1,000 |
|
10 |
Khấu hao sinh phẩm cho kiểm tra lại |
Test |
1,350 |
|
11 |
Kit tách chiết RNA từ virus |
Test |
2,350 |
|
12 |
Primer 1 |
ml |
0,0001 |
|
13 |
Primer 2 |
ml |
0,0001 |
|
14 |
Probe |
ml |
0,0001 |
|
15 |
Ống Eppendorf 1,5 ml |
Tube |
3,000 |
|
16 |
Ống Eppendorf 0,2 ml |
Tube |
1,000 |
|
17 |
Đầu côn 10 µl có lọc |
Cái |
1,000 |
|
18 |
Đầu côn 30 µl |
Cái |
1,200 |
|
19 |
Đầu côn 200 µl có lọc |
Cái |
2,200 |
|
20 |
Đầu côn 1 ml có lọc |
Cái |
3,200 |
|
21 |
Ethanol BDH |
ml |
0,500 |
|
22 |
Water-DEPC Treated |
ml |
2,000 |
|
23 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
24 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
25 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
26 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
27 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
28 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
29 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
30 |
Găng tay |
Đôi |
0,100 |
|
31 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
32 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
33 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
34 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
35 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10,000 |
|
36 |
Khăn lau tay |
cái |
0,010 |
|
37 |
Ngoại kiểm (nếu có)* |
|
0,020 |
* Ghi chú: Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Dịch ngoáy họng, dịch đường hô hấp, các loại dịch khác …
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh: Xem chi tiết phụ lục 2.
Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu: Xem chi tiết phụ lục 6.
Tiến hành kỹ thuật
Tách chiết RNA tổng số.
Thực hiện Real-time RT-PCR.
Phân tích và đánh giá kết quả.
In và trả kết quả.
Nhận định kết quả
Chứng dương phải xuất hiện đồ thị huỳnh quang trên đường giới hạn cơ bản, chứng âm không có bất kỳ đường đồ thị huỳnh quang nào xuất hiện. Đường đồ thị huỳnh quang của mẫu có thể xuất hiện hoặc không xuất hiện trên đường giới hạn cơ bản, căn cứ vào đó để kết luận kết quả.
Những sai sót và xử trí
Trong trường positive control (PC) và negative (NC) xuất hiện không đúng với diễn giải ở phần IV thì phải kiểm tra lại Master mix và chứng dương và quá trình tách RNA tổng số, và thực hiện lại toàn bộ xét nghiệm.
Nếu đường đồ thị huỳnh quang của mẫu xuất hiện ở ngoài chu kỳ thứ 40 thì phải cẩn thận kiểm tra và đánh giá lại mẫu.
