Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Phát hiện kháng thể kháng xoắn khuẩn giang mai trong huyết tương (huyết thanh) của người bệnh bị giang mai.
Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý của phản ứng ngưng kết. Tế bào (hồng cầu) đã được gắn kháng nguyên xoắn khuẩn giang mai, khi cho tiếp xúc huyết thanh (huyết tương) của người bệnh giang mai sẽ bị ngưng kết.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Máy lắc tròn tốc độ 100 vòng/ phút (nếu có).
Máy ly tâm thường.
Tủ lạnh 4ºC -8ºC.
Micropipette các loại: 5 µl – 10 µl, 25 µl, 75 µl, 200 µl.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
Định mức sinh phẩm và vật tư tiêu hao cho 1 mẫu/lần thực hiện (VD).
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Bông |
Kg |
0,001 |
|
2 |
Dây garô |
Cái |
0,001 |
|
3 |
Cồn |
ml |
1,000 |
|
4 |
Bơm kim tiêm |
Cái |
1,000 |
|
5 |
Panh |
Cái |
0,0001 |
|
6 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
7 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Cái |
0,001 |
|
8 |
Tube đựng bệnh phẩm |
Cái |
1,000 |
|
9 |
Sinh phẩm TPHA |
Test |
1,000 |
|
10 |
Khấu hao sinh phẩm TPHA cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng |
Test |
6,000 |
|
11 |
Đầu côn 200 µl |
Cái |
6,000 |
|
12 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
13 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
14 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
15 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
16 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
17 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
18 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
19 |
Găng tay |
Đôi |
0,100 |
|
20 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
21 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
22 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
23 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
24 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10,000 |
|
25 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,010 |
Bệnh phẩm
Huyết thanh hoặc huyết tương của người bệnh.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (xem phụ lục 2).
Từ chối những bệnh phẩm không đạt yêu cầu (xem phụ lục 6).
Tiến hành kỹ thuật
Bộ sinh phẩm TPHA new M của BIO-Rad (VD).
Phản ứng tpha định tính
|
Các bước |
Nội dung thực hiện |
|
1. |
Để sinh phẩm ở nhiệt độ phòng. Pha loãng huyết thanh 1/20. |
|
2. |
Huyết thanh pha loãng 1/20 ở giếng số một nhỏ vào giếng thứ 2 và thứ 3. |
|
3. |
Nhỏ control cell (dung dịch tế bào không gắn kháng nguyên) vào giếng 2 (độ pha loãng của huyết thanh là 1/80) theo hướng dẫn. |
|
4. |
Nhỏ test cell (dung dịch tế bào gắn kháng nguyên) vào giếng 3 (độ pha loãng của huyết thanh là 1/80) theo hướng dẫn. |
|
5. |
Lắc nhẹ phiến nhựa hoặc để máy rung ở tốc độ… trong 5 phút. |
|
6. |
Đậy khay nhựa và để nhiệt độ phòng từ 45 – 60 phút. |
|
7. |
Nhận định kết quả sau 45 – 60 phút. |
Phản ứng tpha định lượng
Huyết thanh người bệnh được pha loãng theo tỷ lệ 1/20, 1/40, 1/80, 1/160…
|
Các bước |
Nội dung thực hiện |
|
1. |
Pha loãng huyết thanh 1/20. |
|
2. |
Nhỏ huyết thanh pha loãng 1/20 nhỏ vào giếng 2 và 3 theo hướng dẫn. |
|
3. |
Nhỏ dung dịch pha loãng huyết thanh vào mỗi giếng từ thứ 4 trở đi theo hướng dẫn. |
|
4. |
Nhỏ huyết thanh pha loãng 1/20 nhỏ vào giếng thứ 4 trộn đều, chuyển tiếp huyết thanh pha loãng sang giếng sau, tiếp tục như vậy tới độ pha loãng cần thiết theo hướng dẫn. |
|
5. |
Nhỏ dung dịch control cell vào giếng 2 theo hướng dẫn. |
|
6. |
Nhỏ test cell vào các giếng tiếp theo, theo hướng dẫn. |
|
7. |
Lắc nhẹ, để ở nhiệt độ phòng. |
|
8. |
Nhận định kết quả sau 45 phút. |
Nhận định kết quả
Điều kiện phản ứng
Giếng hai chứa mẫu bệnh phẩm với dung dịch tế bào không gắn kháng nguyên (control cell) phải âm tính: Tế bào lắng xuống đáy giếng thành một nút nhỏ (nồng độ pha loãng 1:80).
Mẫu xét nghiệm chứng dương phải dương tính.
Mẫu xét nghiệm chứng âm phải âm tính.
Đọc kết quả
Đặt nhẹ nhàng phiến nhựa lên mặt phẳng, đọc với nguồn ánh sáng trực tiếp. So sánh hình thái ngưng kết của các mẫu thử với mẫu chứng âm tính và chứng dương tính, nhận định kết quả theo bảng sau:
|
Kêt quả |
Test cell |
Control cell |
|
Dương tính mạnh |
Tế bào ngưng kết dàn mỏng toàn bộ đáy giếng. |
Tế bào lắng tạo thành nút nhỏ ở đáy giếng. |
|
Dương tính yếu |
Tế bào ngưng kết dàn mỏng 1/3 đáy giếng. |
Tế bào lắng tạo thành nút nhỏ ở đáy giếng. |
|
Âm tính |
Tế bào lắng xuống tạo thành một nút nhỏ ở đáy giếng. |
Tế bào lắng tạo thành nút nhỏ ở đáy giếng. |
|
Không xác định*
|
Tế bào lắng xuống giống hình một cái nhẫn có viền đều xung quanh. |
Tế bào lắng tạo thành nút nhỏ ở đáy giếng. |
|
Phản ứng không đặc hiệu |
Phản ứng dương tính. |
Phản ứng dương tính. |
* Nếu một mẫu ngưng kết với cả giếng có tế bào không gắn kháng nguyên (control cell) và giếng có tế bào gắn kháng nguyên (test cell) cần phải làm lại mẫu với thao tác hấp phụ:
+ Nhỏ 100µl mẫu bệnh phẩm vào ống nghiệm.
+ Nhỏ tiếp 400µl control cell.
+ Đồng nhất phản ứng bằng cách trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng 1 giờ.
+ Ly tâm ở 1000 vòng x15 phút.
+ Dùng pipet hút lấy nước nổi ở bề mặt (độ pha loãng mẫu là 1:5) để làm phản ứng. Cần phải tính toán lại khi pha loãng mẫu.
Những sai sót và xử trí
Thực hiện đúng các bước kỹ thuật theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Tham khảo thêm hướng dẫn của nhà sản xuất.
