Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Xác định sự có mặt DNA của Ureaplasma urealyticum trong bệnh phẩm của người.
Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)
Trang thiết bị
Tủ an toàn sinh học cấp 2
Máy ủ nhiệt
Máy ly tâm > 12000 gpm/phút
Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml
Máy vortex
Máy Real-time PCR
Ống Eppendorf 1,5 ml ho c 2 ml
Các loại Micropipette điều chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl
Đầu côn có màng lọc 10 μl, 100 μl, 200 μl và 1000 μl
Tủ lạnh thường
Tủ âm sâu (200C) ho c (-700C) (nếu có)
Bộ lưu điện
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
|
|||
|
1 |
Dụng cụ lấy bệnh phẩm |
Cái |
|
|||
|
2 |
Găng không bột tal |
cái |
|
|||
|
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
|||
|
|
3 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
|||
|
|
4 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Test |
|||
|
|
5 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
|||
|
|
6 |
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng |
Test |
|||
|
|
7 |
Kit tách chiết DNA |
Test |
|||
|
|
9 |
Ống Falcon 50 ml |
Cái |
|||
|
|
10 |
Eppendorf 1,7 ml |
Tube |
|||
|
|
11 |
Eppendorf 0,2 ml |
Tube |
|||
|
|
12 |
Đầu côn 10 µl có lọc |
Cái |
|||
|
|
13 |
Đầu côn 30 µl |
Cái |
|||
|
|
14 |
Đầu côn 200 µl có lọc |
Cái |
|||
|
|
15 |
Đầu côn 1ml có lọc |
Cái |
|||
|
|
16 |
Water-DEPC treated |
ml |
|||
|
|
17 |
Giấy thấm |
Cuộn |
|||
|
|
18 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
|||
|
|
19 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
|||
|
|
20 |
Bút viết kính |
Cái |
|||
|
|
21 |
Bút bi |
Cái |
|||
|
|
22 |
M |
Cái |
|||
|
|
23 |
Khẩu trang |
Cái |
|||
|
|
24 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
|||
|
|
25 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
|||
|
|
26 |
Dung dịch xà phòng rửa tay |
ml |
|||
|
|
27 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
|||
|
|
28 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
|||
|
|
29 |
Khăn lau tay |
Cái |
|||
|
|
30 |
Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)* |
|
|||
Ghi chú:
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo
Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Mủ hoặc dịch niệu đạo, âm đạo, dịch ngoáy họng.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).
Tiến hành kỹ thuật:
VD sinh phẩm hóa chất vật tư tiêu hao Ureaplasma urealyticum rPCR kít hoặc tương đương
Tách chiết DNA
Cho một lượng mẫu DNA tách chiết được vào các ống phản ứng PCR có chứa các thành phần cần thiết của kit
Chạy phản ứng PCR theo chu trình nhiệt thích hợp trên máy Real-time PCR
Đọc kết quả
Nhận định kết quả
Bước 1: kiểm tra nguy cơ ngoại nhiễm
Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu không bị ngoại nhiễm.
Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu FAM: mẫu bị ngoại nhiễm, phải tiến hành tách chiết DNA lại.
Bước 2: kiểm tra độ nhạy
Chọn chứng (+) và chứng (-) và phân tích trên kênh màu FAM và HEX – Kết quả chứng (-) có đường tín hiệu khuyếch đại với kênh màu HEX: PCR không bị ức chế.
Kết quả chứng (-) không có đường tín hiệu khuyếch đại ho c tín hiệu thấp với kênh màu HEX, PCR bị ức chế toàn phần hay một phần, tách chiết DNA lại hoặc pha loãng DNA trước khi chạy PCR.
Bước 3: xác định mẫu dương tính
Mẫu có tín hiệu huỳnh quang với kênh màu FAM và có Ct: là những mẫu dương tính
Các mẫu có Ct
pha loãng DNA mẫu với tỉ lệ 1/5 trước khi cho vào PCR master mix
Bước 4: xác định mẫu âm tính
Mẫu không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và dương tính với màu HEX, thì kết quả là mẫu bệnh phẩm âm tính
Nếu mẫu có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM nhưng không có Ct và dương tính với màu HEX, thì kết quả dưới ngưỡng phát hiện
Nếu mẫu không có tín hiệu khuyếch đại với màu FAM và âm tính với màu HEX , mẫu bị ức chế cần tiến hành lại PCR với DNA đã pha loãng hoặc tách chiết lại. Nếu kết quả vẫn như cũ thì phải lấy lại mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm.
Những sai sót và xử trí
Phản ứng dương tính giả: do tạp nhiễm từ môi trường
Phản ứng âm tính giả: do phản ứng PCR bị ức chế
Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân thủ chặt chẽ quy trình kỹ thuật.
