Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Định danh vi nấm.
Nguyên lý
Định danh vi nấm bằng kỹ thuật xác định trình tự nucleotide của gen đặc trưng.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh – Ký sinh trùng.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh – Ký sinh trùng.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Tủ an toàn Sinh học cấp 2.
Máy PCR.
Máy đọc điện di.
Máy giải trình tự gen.
Máy ly tâm 16000 vòng/phút .
Máy ủ nhiệt.
Máy vortex.
Micropipette.
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Bông |
kg |
0,001 |
|
2 |
Cồn |
ml |
1,000 |
|
3 |
Bơm kim tiêm |
Cái |
1,000 |
|
4 |
Panh |
Cái |
0,0001 |
|
5 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
6 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Test |
0,001 |
|
7 |
Tube đựng bệnh phẩm |
Cái |
2,000 |
|
8 |
Găng không có bột (DNase-RNase free) |
Cái |
0,500 |
|
9 |
Sinh phẩm chẩn đoán |
Test |
1,000 |
|
10 |
Khấu hao sinh phẩm cho kiểm tra lại |
Test |
1,350 |
|
11 |
Kit tách chiết ADN |
Test |
2,350 |
|
12 |
DNA marker |
Bộ |
1,000 |
|
13 |
Primer 1 (primer đặc hiệu) |
ml |
0,0001 |
|
14 |
Primer 2 (primer đặc hiệu) |
ml |
0,0001 |
|
15 |
Primer 3 (primer đặc hiệu) |
ml |
0,0001 |
|
16 |
Primer 4 (primer đặc hiệu) |
ml |
0,0001 |
|
17 |
Ống Eppendorf 1,5 ml |
Tube |
3,000 |
|
18 |
Ống Eppendorf 0,2 ml |
Tube |
1,000 |
|
19 |
Đầu côn 10 ul có lọc |
Cái |
1,000 |
|
20 |
Đầu côn 30 ul |
Cái |
1,200 |
|
21 |
Đầu côn 200 ul có lọc |
Cái |
2,200 |
|
22 |
Đầu côn 1 ml có lọc |
Cái |
3,200 |
|
23 |
Ethanol BDH |
ml |
0,500 |
|
24 |
Water-DEPC Treated |
ml |
2,000 |
|
25 |
Giấy thấm |
Cuộn |
0,100 |
|
26 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
27 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
28 |
Bút viết kính |
Cái |
0,020 |
|
29 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
30 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
31 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
32 |
Găng tay |
Đôi |
0,100 |
|
33 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
34 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,005 |
|
35 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
36 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
37 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
10,000 |
|
38 |
Khăn lau tay |
cái |
0,010 |
Bệnh phẩm
Chủng nấm đã được nuôi cấy thuần.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục 5).
Tiến hành kỹ thuật
Tách chiết DNA tổng số.
Thực hiện PCR.
Điện di kiểm tra sản phẩm.
Giải trình tự gen.
Kiểm tra và so sánh trình tự gen của nấm trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế.
Nhận định kết quả
Sản phẩm PCR phải có một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét và không bị đứt gẫy. Trình tự ADN của gen đích không bị nhiễu và phải có độ tương đồng ≥ 90% mới có thể kết luận được loại nấm.
Những sai sót và xử trí
Trong trường hợp không có sản phẩm PCR, cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết DNA tổng số, chất lượng của primers và master mix, và thực hiện lại toàn bộ xét nghiệm.
Nếu trình tự DNA bị nhiễu cần phải kiểm tra lại độ đặc hiệu của sản phẩm PCR hoặc quá trình chạy PCR sequencing bị nhiễm chéo.
