Mục đích, nguyên lý
Mục đích
Định danh vi nấm gây bệnh.
Nguyên lý
Nuôi cấy, định danh vi nấm dựa trên các tính chất về hình thể, cấu tạo, bắt màu và một số tính chất sinh vật, hóa học của nấm.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh – Ký sinh trùng.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh – Ký sinh trùng.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Kính hiển vi.
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Máy ly tâm.
Tủ ấm.
Máy tính cài phần mềm đọc API (nếu có).
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Lọ lấy bệnh phẩm |
Lọ |
1,000 |
|
2 |
Que cấy |
Cái |
2,000 |
|
3 |
Lam kính |
Cái |
2,000 |
|
4 |
Lá kính |
Cái |
1,000 |
|
5 |
Lactophenol Coton Blue |
Ml |
1,000 |
|
6 |
Nước muối sinh lý |
Ml |
5,000 |
|
7 |
KOH 20 % |
Ml |
5,000 |
|
8 |
Mực tàu |
Ml |
0,500 |
|
9 |
Sabouraud |
Đĩa |
1,000 |
|
10 |
Candiselect |
Đĩa |
0,500 |
|
11 |
Giá đường API |
Test |
0,500 |
|
12 |
RAT |
Ống |
1,000 |
|
13 |
Bông |
Kg |
0,001 |
|
14 |
Cồn 90 độ (vệ sinh dụng cụ) |
ml |
10,000 |
|
15 |
Đèn cồn |
Cái |
0,0001 |
|
16 |
Panh |
Cái |
0,0001 |
|
17 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
18 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
19 |
Mũ |
Cái |
0,020 |
|
20 |
Khẩu trang |
Cái |
0,020 |
|
21 |
Găng tay |
Đôi |
3,000 |
|
22 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,020 |
|
23 |
Quần áo bảo hộ |
Bộ |
0,001 |
|
24 |
Axit ngâm lam |
ml |
10,000 |
|
25 |
Ống nghiệm thủy tinh |
Ống |
1,000 |
|
26 |
Bút viết kính |
Cái |
0,00 |
|
27 |
Bút bi |
Cái |
0,010 |
|
28 |
Bật lửa |
Cái |
0,010 |
|
29 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
30 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
31 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
32 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,030 |
|
33 |
Giấy trả kết quả xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
34 |
QC (nếu thực hiện) * |
|
0,1 |
|
35 |
EQAS (nếu thực hiện) * |
|
0,005 |
Ghi chú:
Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Máu, dịch, mủ, đờm, phân, nước tiểu, da, tóc, móng.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Tham khảo phụ lục 5).
Tiến hành kỹ thuật
nuôi cấy nấm trên môi trường sabouraud ủ ấm ở nhiệt độ 30°c
Bệnh phẩm là da, tóc, móng: Cắt nhỏ bệnh phẩm cấy 6 – 8 điểm trên đĩa Sabouraud.
Bệnh phẩm là các chất dịch: Hút 3- 5 giọt dịch cấy dàn trên đĩa Sabouraud.
Bệnh phẩm là nước tiểu: Sử dụng kỹ thuật cấy định lượng.
soi tươi tìm nấm
Đánh giá sơ bộ.
đọc kết quả hàng ngày
Nhận định kết quả
Quan sát hình thể cấu tạo, tính chất, màu sắc khuẩn lạc.
+ Khuẩn lạc nấm men:
Khuẩn lạc Candida có dạng trơn, nhẵn màu kem thường mọc nhanh sau 24 giờ.
Khuẩn lạc Cryptococcus trơn nhẵn màu be (khô hơn so với nấm Candida) mọc chậm thường sau 48 giờ.
+ Khuẩn lạc nấm mốc:
Aspergillus màu sắc khuẩn lạc khác nhau.
P.marneffei: Sinh sắc tố màu đỏ nâu đến đỏ rượu vang khuếch tán vào môi trường khi nuôi cấy ở nhiệt độ phòng.
Quan sát kính hiển vi sau cấy:
Tế bào nấm men hình tròn hoặc bầu dục (đối với nấm Candida), nẩy chồi hoặc không. Cryptococcus thường hình tròn, kích thước lớn.
Định danh loài nấm men.
+ Định danh sơ bộ 4 loài nấm men tiến hành nuôi cấy vào môi trường Candida select.
+ Định danh nấm men bằng bộ API 20C AUX.
Trả kết quả loài nấm theo kết quả định danh.
Định danh nấm mốc
Làm tiêu bản bằng Lactophenol Coton Blue.
Dựa vào hình thái, màu sắc khuẩn lạc, dựa vào đặc điểm vi thể của từng loài Aspergillus để kết luận loài.
P.marneffei: Trên môi trường Sabouraud khuẩn lạc mọc nhanh, kiểu da lộn cho đến có dạng phủ đầy lông tơ, sinh sắc tố màu đỏ nâu đến đỏ rượu vang khuếch tán vào môi trường.
Âm tính: Không thấy khuẩn lạc mọc sau 4 ngày trả kết quả sơ bộ: Âm tính.
Các đĩa cấy được bỏ sau 7 ngày nuôi cấy.
Những sai sót và xử trí
Để định danh nấm men bằng bộ API 20C AUX cho kết quả chính xác khi lấy khuẩn lạc nấm phải thuần( khuẩn lạc riêng rẽ) tránh bị lẫn.
