Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Đánh giá số lượng coliform.
Phát hiện vi sinh vật gây hoặc có khả năng gây nhiễm trùng bệnh viện.
Nguyên lý
Vi sinh vật được phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy kinh điển. Vi sinh vật được định danh dựa vào đặc điểm nuôi cấy, một số tính chất chuyển hóa, các đặc điểm về hình thái học và có thể kết hợp với tính chất kháng nguyên.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Kính hiển vi quang học.
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Tủ ấm thường.
Tủ ấm CO2.
Máy tính cài phần mềm đọc API (nếu có).
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Lọ lấy bệnh phẩm |
Lọ |
1,000 |
|
2 |
Que cấy |
Cái |
2,000 |
|
3 |
Lam kính |
Cái |
2,000 |
|
4 |
Dầu soi kính |
ml |
1,000 |
|
5 |
Cồn 96 độ lau kính |
ml |
1,000 |
|
6 |
Nước muối sinh lý |
ml |
5,000 |
|
7 |
Thuốc nhuộm đỏ Fucsin |
ml |
5,000 |
|
8 |
Thuốc nhuộm tím Gentian |
ml |
5,000 |
|
9 |
Cồn tẩy 96 độ |
ml |
10,000 |
|
10 |
Lugol |
ml |
5,000 |
|
11 |
Thuốc nhuộm Xanh Methylen |
ml |
5,000 |
|
12 |
Canh thang Lactose đặc 10 ml |
ống |
5,000 |
|
13 |
Canh thang Lactose loãng 5 ml |
ống |
2,000 |
|
14 |
Môi trường thạch máu thường |
Đĩa |
1,000 |
|
15 |
Môi trường Uri select 4 |
Đĩa |
1,000 |
|
16 |
Panel định danh (ống Broth AST, ID, dd Indicator) |
Test |
1,000 |
|
17 |
Panel chứng |
Bộ |
0,0002 |
|
18 |
Bơm kim tiêm |
Cái |
1,000 |
|
19 |
Bông |
Kg |
0,001 |
|
20 |
Cồn 90 độ (vệ sinh dụng cụ) |
ml |
10,000 |
|
21 |
Đèn cồn |
Cái |
0,0001 |
|
22 |
Panh |
Cái |
0,0001 |
|
23 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
24 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
25 |
Mũ |
Cái |
0,02 |
|
26 |
Khẩu trang |
Cái |
0,02 |
|
27 |
Găng tay |
Đôi |
3,000 |
|
28 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,02 |
|
29 |
Quần áo |
Bộ |
0,001 |
|
30 |
Axits ngâm lam |
ml |
10,000 |
|
31 |
Ống nghiệm thủy tinh |
Ống |
1,000 |
|
32 |
Bút viết kính |
Cái |
0,02 |
|
33 |
Bút bi |
Cái |
0,01 |
|
34 |
Bật lửa |
Cái |
0,01 |
|
35 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
36 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
37 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
38 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,03 |
|
39 |
Giấy trả kết quả xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
40 |
QC |
|
0,1 |
|
41 |
EQAS |
|
0,005 |
Môi trường nuôi cấy và hóa chất định danh vi khuẩn được tính trên tỉ lệ dương tính trung bình là 50% cho các loại bệnh phẩm.
* Ghi chú:
Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Nước vô trùng rửa tay phẫu thuật, thủ thuật
Nước sinh hoạt tại cơ sở y tế.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Chọn địa điểm, số lượng và thời gian lấy mẫu có thể đánh giá chất lượng vi khuẩn toàn bộ hệ thống cung cấp nước từ đầu nguồn, giữa nguồn và cuối nguồn.
Mở nước chảy hết cỡ 2 – 3 phút. Đóng vòi và khử khuẩn kỹ vòi bằng nhiệt độ bông cồn. Mở lại cho chảy mạnh 2 – 3 phút rồi điều chỉnh chảy vừa đủ để lấy mẫu, tránh không gây bắn ra ngoài. Dùng chai thuỷ tinh, nút mài vô khuẩn lấy 100 ml cho mục đích kiểm tra chất lượng về vi khuẩn học, 1000ml cho phân tích vi khuẩn gây bệnh. Lấy xong đốt miệng lọ để sát khuẩn và đậy kín ống nghiệm.
Tiến hành kỹ thuật
định lượng coliform bằng kỹ thuật đếm số có xác xuất lớn nhất (mpn: most probable number)
Phương pháp cấy 7 ống:
+ 05 ống canh thang lactose đặc, mỗi ống cấy 10ml nước mẫu ở đậm độ nguyên chất.
+ 01 ống canh thang lactose loãng, cấy 1 ml nước nguyên chất.
+ 01 ống canh thang lactose loãng cấy 1ml nước ở đậm độ 10-1 hoặc 0,1 ml nước mẫu.
+ Hàng thứ 4, 5,… tiếp tục cấy đến đậm độ cần thiết.
Nuôi cấy và ủ ấm: Ủ ấm 35-37ºC trong vòng 48 giờ ± 3, khí trường thường.
Đọc kết quả: Những ống lên men lactose sinh acid, chuyển màu môi trường xanh sang vàng và sinh hơi trong ống sinh hơi được coi là dương tính (+). Ghi tất cả những ống (+) theo các đậm độ cấy:
+ 05 ống canh thang lactose đặc, cấy 10ml (+) ghi 5.
+ 01 ống canh thang lactose loãng (+) ghi 1.
+ 01 ống canh thang lactose loãng (+) ghi 1.
Xác định dãy số phương pháp 7 ống là: 5 1 1.
Phát hiện vi sinh vật gây bệnh
Nuôi cấy và ủ ấm canh thang ở 35-37ºC trong vòng 48 giờ ± 3, khí trường thường.
Đánh giá độ đục của canh thang.
Nếu canh thang đục thì nhuộm Gram để nhận định hình thể từng loại vi khuẩn.
Định danh từng loại vi khuẩn dựa vào các tính chất sinh vật hóa học.
Nhận định kết quả
Định lượng coliform
Chọn các ống lên men lactose và sinh hơi trong canh thang để xác định được các dãy số. Tra bảng MPN cho phương pháp cấy 7 ống để tính số lượng vi khuẩn/100 ml nước.
Phát hiện vi sinh vật gây bệnh
Dương tính: Có vi sinh vật gây bệnh trong nước sinh hoạt. Phân lập và định danh được vi khuẩn gây bệnh. Trả kết quả tên vi khuẩn đến mức độ chi và/hoặc loài.
Âm tính: Không tìm thấy hoặc không phân lập được vi sinh vật.
Những sai sót và xử trí
Coliform là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí, kỵ khí tuỳ tiện, không nha bào, có khả năng lên men lactose sinh acid, sinh hơi ở 35 – 37ºC trong vòng 48 giờ. Chúng được tìm thấy trong phân người, động vật và cả trong môi trường như đất, nước, rau quả… Coliform được coi là chỉ điểm vệ sinh quan trọng. Nồng độ coliform trong nước chứng minh rằng biện pháp khử khuẩn chưa đạt hiệu quả. Khi xét nghiệm mẫu nước có vi khuẩn vượt quá tiêu chuẩn qui định cần áp dụng một số biện pháp can thiệp tạm thời cho đến khi nguồn nước được xử lý.
