Mục đích và nguyên lý
Mục đích
Đánh giá số lượng coliform có trong nước thải sau xử lý tại cơ sở y tế.
Nguyên lý
Vi sinh vật được phát hiện bằng phương pháp nuôi cấy kinh điển. Vi sinh vật được định danh dựa vào đặc điểm nuôi cấy, một số tính chất chuyển hóa, các đặc điểm về hình thái học và có thể kết hợp với tính chất kháng nguyên.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh.
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Cán bộ xét nghiệm có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh.
Phương tiện, hóa chất
Phương tiện, hóa chất như ví dụ dưới đây hoặc tương đương.
Trang thiết bị
Kính hiển vi quang học.
Tủ an toàn sinh học cấp 2.
Tủ ấm thường.
Tủ ấm CO2.
Máy tính cài phần mềm đọc API (nếu có).
Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơn vị |
Số lượng |
|
1 |
Lọ lấy bệnh phẩm |
Lọ |
1,000 |
|
2 |
Que cấy |
Cái |
2,000 |
|
3 |
Lam kính |
Cái |
2,000 |
|
4 |
Dầu soi kính |
ml |
1,000 |
|
5 |
Cồn 96 độ lau kính |
ml |
1,000 |
|
6 |
Nước muối sinh lý |
ml |
5,000 |
|
7 |
Thuốc nhuộm đỏ Fucsin |
ml |
5,000 |
|
8 |
Thuốc nhuộm tím Gentian |
ml |
5,000 |
|
9 |
Cồn tẩy 96 độ |
ml |
10,000 |
|
10 |
Lugol |
ml |
5,000 |
|
11 |
Nước muối sinh lý 5ml |
ống |
9,000 |
|
12 |
Thuốc nhuộm Xanh Methylen |
ml |
5,000 |
|
13 |
Canh thang Lactose đặc 10 ml |
ống |
3,000 |
|
14 |
Canh thang Lactose loãng 5 ml |
ống |
24,000 |
|
15 |
Môi trường thạch máu thường |
Đĩa |
1,000 |
|
16 |
Môi trường Uri select 4 |
Đĩa |
1,000 |
|
17 |
Panel định danh (ống Broth AST, ID, dd Indicator) |
Test |
1,000 |
|
18 |
Panel chứng |
Bộ |
0,0002 |
|
19 |
Bơm kim tiêm |
Cái |
1,000 |
|
20 |
Bông |
Kg |
0,001 |
|
21 |
Cồn 90 độ (vệ sinh dụng cụ) |
ml |
10,000 |
|
22 |
Đèn cồn |
Cái |
0,0001 |
|
23 |
Panh |
Cái |
0,0001 |
|
24 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
25 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Cái |
0,0001 |
|
26 |
Mũ |
Cái |
0,02 |
|
27 |
Khẩu trang |
Cái |
0,02 |
|
28 |
Găng tay |
Đôi |
3,000 |
|
29 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
0,02 |
|
30 |
Quần áo |
Bộ |
0,001 |
|
31 |
Axits ngâm lam |
ml |
10,000 |
|
32 |
Ống nghiệm thủy tinh |
Ống |
1,000 |
|
33 |
Bút viết kính |
Cái |
0,02 |
|
34 |
Bút bi |
Cái |
0,01 |
|
35 |
Bật lửa |
Cái |
0,01 |
|
36 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
0,001 |
|
37 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
1,000 |
|
38 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
8,000 |
|
39 |
Khăn lau tay |
Cái |
0,03 |
|
40 |
Giấy trả kết quả xét nghiệm |
Tờ |
2,000 |
|
41 |
QC |
|
0,1 |
|
42 |
EQAS |
|
0,005 |
Môi trường nuôi cấy và hóa chất định danh vi khuẩn được tính trên tỉ lệ dương tính trung bình là 50% cho các loại bệnh phẩm.
* Ghi chú:
Chi phí nội kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình nội kiểm (QC) là 1/10 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lượng ≥ 10 mẫu cho 1 lần tiến hành kỹ thuật).
Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
Bệnh phẩm
Nước thải sau xử lý tại cơ sở y tế.
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
Các bước tiến hành
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.
Lấy bệnh phẩm
Chọn địa điểm, số lượng mẫu và thời gian lấy mẫu có thể đánh giá chất lượng vi khuẩn học toàn bộ nguồn nước thải bệnh viện. Thường lấy tại bể tập trung toàn bệnh viện để đánh giá ô nhiễm vi sinh từ đầu nguồn. Lấy mẫu sau từng giai đoạn xử lý và đầu ra sau xử lý. Vì lượng nước thải không đều, nên lấy mẫu vào nhiều thời điểm trong ngày rồi trộn các mẫu lại thành một mẫu gọi là mẫu trộn.
Dùng quang chai đã khử khuẩn bằng nhiệt độ bông cồn. Dìm quang chai sâu cách mặt nước 30 cm, khi nước gần đầy chai thì kéo lên để lại trống chừng khoảng 2 – 3 cm từ mặt dưới nút chai trở xuống để tránh nhiễm khuẩn từ miệng nút chai và để khi phân tích lắc trộn mẫu được dễ dàng. Dùng chai thuỷ tinh, nút mài vô khuẩn lấy 100 ml cho mục đích kiểm tra chất lượng về vi khuẩn học, 1.000ml cho phân tích vi khuẩn gây bệnh. Lấy xong đốt miệng lọ để sát khuẩn và đậy kín ống nghiệm. Khử khuẩn tại miệng chai nút chai, đóng nút nhanh và bao lại miệng chai cẩn thận.
Nếu không có quang chai, phải rửa tay xà phòng sạch sẽ, lau cồn khử khuẩn tay. Sau đó cầm gần đáy chai, dìm chai xuống nước, đặt chai nằm ngang hơi chúc đầu xuống độ sâu khoảng 15-20 cm để ngang chai tạo dòng nước tự chảy vào miệng chai, tránh lấy nước trên bề mặt. Các thao tác khác thực hiện như đã mô tả ở trên.
Trường hợp không lấy được trực tiếp, phải dùng xô, gầu múc, cần đổ bỏ 3 lần, lần thứ tư mới rót nhẹ nhàng vào chai sao cho tay không làm nhiễm bẩn mẫu nước.
Tiến hành kỹ thuật định lượng coliform bằng kỹ thuật đếm số có xác xuất lớn nhất (mpn: most probable number)
phương pháp cấy nhiều ống
Chuẩn bị: Có thể xếp 5 hàng, mỗi hàng 3 ống hoặc 5 ống, hàng đầu là những ống canh thang lactose đặc và 2 hàng sau là những ống canh thang lactose loãng.
Pha loãng: hút vô khuẩn 1ml mẫu nước nguyên cho vào nước muối sinh lý 0,85% chứa 9 ml để có đậm độ pha loãng 10-1. Hút trộn lên xuống 20 – 25 lần để trộn đều mẫu với nước muối. Từ đậm độ này, lại hút 1ml chuyển sang ống nước muối thứ 2, có đậm độ pha loãng10-2. Cứ như thế pha loãng tới đậm độ cần thiết. Mỗi đậm độ thay pipet mới.
+ Hàng thứ nhất xếp 3 ống canh thang lactose đặc, cấy mỗi ống 10 ml nước mẫu.
+ Hàng thứ 2 xếp 3 ống canh thang lactose loãng, cấy mỗi ống 1 ml mẫu nước.
+ Hàng thứ 3 xếp 3 ống canh thang lactose loãng, cấy mỗi ống 1 ml mẫu nước đậm độ 10-1.
+ Hàng thứ 4, 5,… tiếp tục cấy đến đậm độ cần thiết.
Nuôi cấy và ủ ấm 35 – 37ºC trong vòng 48 giờ ± 3, khí trường thường.
Đọc kết quả: Những ống lên men lactose sinh acid, chuyển màu môi trường xanh sang vàng và sinh hơi trong ống sinh hơi được coi là dương tính (+). Ghi tất cả những ống (+) theo các đậm độ cấy:
+ 3 ống canh thang lactose đặc, cấy 10 ml, (+) cả 3 ghi 3.
+ 3 ống canh thang lactose loãng, cấy 1 ml nước (+) cả 3 ghi 3.
+ 3 ống canh thang lactose, loãng, cấy 1 ml nước 10-1 (+) cả 3 ghi 3.
+ 3 ống canh thang lactose loãng, cấy 1 ml nước 10-2 , chỉ (+) 2 ghi 2.
+ 3 ống canh thang lactose loãng, cấy 1 ml nước 10-3, (-) cả 3 ghi 0.
Xác định dãy số phương pháp nhiều ống là: 3 3 3 2 0.
Nhận định kết quả
Định lượng coliform
Chọn các ống lên men lactose và sinh hơi trong canh thang để xác định được các dãy số. Tra bảng MPN cho phương pháp cấy 9 ống hoặc 15 ống để tính số lượng vi khuẩn/100 ml nước.
Những sai sót và xử trí
Nếu xét nghiệm mẫu nước thải có số lượng coliform vượt quá tiêu chuẩn qui định cần áp dụng một số biện pháp can thiệp tạm thời cho đến khi nguồn nước được xử lý.
