Nguyên lý
Định danh virus bằng kỹ thuật xác định trình tự nucleotide của gen đặc trưng.
Chuẩn bị
Người thực hiện
Người thực hiện: Người thực hiện đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh hoặc chuyên ngành tương đương (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).
Phương tiện, hóa chất
trang thiết bị
Tủ an toàn sinh học cấp 2
Tủ thao tác PCR (PCR Workstation)
Máy PCR
Hệ thống điện di
Máy giải trình tự gen
Máy ly tâm 25000 x g
Máy ủ nhiệt
Máy vortex
Pipette
Tủ đông sâu (-20oCvà -70oC)
Máy vi tính và phần mềm phân tích trình tự
dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
|
STT |
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao |
Đơnvị |
|
1 |
Bông |
kg |
|
2 |
Cồn |
ml |
|
3 |
Bơm kim tiêm |
Cái |
|
4 |
Panh |
Cái |
|
5 |
Khay đựng bệnh phẩm |
Cái |
|
6 |
Hộp vận chuyển bệnh phẩm |
Test |
|
7 |
Tube đựng bệnh phẩm |
Cái |
|
8 |
Găng không có bột (DNase-RNase free) |
Cái |
|
9 |
PCR master mix |
Test |
|
10 |
Men Polymerase hoặcTaq Polymerase |
ml |
|
11 |
Khấu hao sinh phẩm cho chẩn đoán và kiểm tra chất lượng |
Test |
|
12 |
Kit táchchiết ADN/ARN |
Test |
|
13 |
Kit tinh sạch DNA sau PCR |
Test |
|
14 |
Kit tinh sach sản phẩm sau nhuộm màu (sau PCR sequencing) |
Test |
|
15 |
DNA marker |
Bộ |
|
16 |
Primer 1 (primer đặc hiệu) |
ml |
|
17 |
Primer 2 (primer đặc hiệu) |
ml |
|
18 |
Primer 3 (primer đặc hiệu) |
ml |
|
19 |
Primer 4 (primer đặc hiệu) |
ml |
|
20 |
Kit nhuộm màu trình tự (Big dye) – PCR sequencing |
Test |
|
21 |
Plate/tube cho máy đọc trình tự |
Cái |
|
22 |
Gel điện di cho máy đọc trình tự |
Gram |
|
23 |
Cartrigde cho máy đọc trình tự |
Test |
|
24 |
Ống Eppendorf 1,5 ml |
Tube |
|
25 |
Ống Eppendorf 0,2 ml |
Tube |
|
26 |
Đầu côn 10 ul có lọc |
Cái |
|
27 |
Đầu côn 30 ul có lọc |
Cái |
|
28 |
Đầu côn 200 ul có lọc |
Cái |
|
29 |
Đầu côn 1 ml có lọc |
Cái |
|
30 |
Ethanol BDH |
ml |
|
31 |
Water-DEPC Treated |
ml |
|
32 |
Giấy thấm |
Cuộn |
|
33 |
Giấy xét nghiệm |
Tờ |
|
34 |
Sổ lưu kết quả xét nghiệm |
Tờ |
|
35 |
Bút viết kính |
Cái |
|
36 |
Bút bi |
Cái |
|
37 |
Mũ |
Cái |
|
38 |
Khẩu trang |
Cái |
|
39 |
Găng tay |
Đôi |
|
40 |
Găng tay xử lý dụng cụ |
Đôi |
|
41 |
Quần áo |
Bộ |
|
42 |
Dung dịch nước rửa tay |
ml |
|
43 |
Cồn sát trùng tay nhanh |
ml |
|
44 |
Dung dịch khử trùng |
ml |
|
45 |
Khăn lau tay |
cái |
Bệnh phẩm
Bệnh phẩm cơ thể có chứa căn nguyên virus nghi ngờ
Phiếu xét nghiệm
Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu
Các bước tiến hành
Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem phụ lục).
Tiến hành kỹ thuật
Tách chiết DNA/RNA tổng số
Thực hiện PCR
Điện di kiểm tra sản phẩm
Giải trình tự gen
Kiểm tra và so sánh trình tự gen trên ngân hàng dữ liệu gen quốc tế
Thời gian thực hiện
2 – 5 ngày
Nhận định kết quả
Sản phẩm PCR phải có một băng đặc hiệu duy nhất, rõ nét và không bị đứt gẫy. Trình tự ADN của gen đích không bị nhiễu và phải có độ tương đồng ≥ 90 % mới có thể kết luận được.
Những sai sót và xử trí
Trong trường hợp không có sản phẩm PCR, cần phải kiểm tra lại quá trình tách chiết DNA tổng số, chất lượng của primers và master mix, và thực hiện lại toàn bộ xét nghiệm.
Nếu trình tự DNA bị nhiễu cần phải kiểm tra lại độ đặc hiệu của sản phẩm PCR hoặc quá trình chạy PCR sequencing bị nhiễm chéo.
