Virus real-time pcr

Mục đích và nguyên lý

Mục đích

Xác định DNA hoặc ARN đặc trưng của virus cần tìm.

Nguyên lý

Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR. 

Chuẩn bị

Người thực hiện

Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại học hoặc sau đại học về chuyên ngành Vi sinh (và/hoặc sinh học phân tử/ sinh học/công nghệ sinh học).

Phương tiện, hóa chất (ví dụ hoặc tương đương)

Trang thiết bị

Tủ an toàn sinh học cấp 2

Máy ủ nhiệt

Máy ly tâm bàn dùng cho ống bệnh phẩm 5ml 

Máy ly tâm lạnh dùng cho tube 0,2 ml

Máy vortex

Máy chạy PCR

Máy chạy Real-time PCR và hệ thống máy vi tính.

Các loại Micropipette đi u chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl

Tủ lạnh thường

Tủ âm sâu (-20⁰C) hoặc (-70⁰C) (nếu có)

Bộ lưu điện

Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)

STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị
1	Bông	Kg
2	Dây garô	Cái
3	Cồn	ml
4	Bơm kim tiêm	Cái
STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị
5	Panh	Cái
6	Khay đựng bệnh phẩm	Cái
7	Hộp vận chuyển bệnh phẩm	Test
8	Dụng cụ lấy bệnh phẩm (Ống chống đông 5ml có chứa EDTA/ Tăm bông vô trùng/ Tube đựng bệnh phẩm vô trùng)	Ống
9	Tube 1,5ml vô trùng	Tube
10	Găng không có bột (DNase-RNase free)	Đôi
11	Bộ kít chiết tách DNA/RNA tổng số	Hộp
12	Bộ kít tổng hợp cDNA (Nếu là virus RNA)	Hộp
13	Sinh phẩm chẩn đoán	Test
14	Khấu hao sinh phẩm cho mẫu chứng và kiểm tra chất lượng, standard các loại	Test
15	Ependoff 1,7ml	Tube
16	Ependoff 0,2ml	Tube
17	Đầu côn 10 µl có lọc	Cái
18	Đầu côn 30 µl có lọc	Cái
19	Đầu côn 200 µl có lọc	Cái
20	Đầu côn 1 ml có lọc	Cái
21	Water-DEPC Treated	ml
22	Giấy thấm không bụi	Cuộn
23	Giấy xét nghiệm	Tờ
24	Sổ lưu kết quả xét nghiệm	Tờ
25	Bút viết kính	Cái
26	Bút bi	Cái
27	Mũ	Cái
28	Khẩu trang	Cái
29	Găng tay xử lý dụng cụ	Đôi
30	Quần áo bảo hộ	Bộ
31	Dung dịch xà phòng rửa tay	ml
32	Cồn sát trùng tay nhanh	ml
STT	Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao	Đơn vị
33	Dung dịch khử trùng	ml
34	Khăn lau tay	Cái
35	Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*

Ghi chú: 

Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình ngoại kiểm (EQAS) là 1/50 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với số lần ngoại kiểm trung bình 3 lần/1 năm).

Bệnh phẩm

Các loại bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm virus cần tìm

Phiếu xét nghiệm

Điền đầy đủ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu

Các bước tiến hành

Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ ở trên.

Lấy bệnh phẩm

Theo đúng quy định của chuyên ngành Vi sinh (Xem Phụ lục).

Tiến hành kỹ thuật

Thu nhận và xử lý mẫu: 

Tất cả loại bệnh phẩm khi chứa nhiều tạp nhiễm cần được thuần nhất trước khi tách chiết.

Tách chiết dna hoặc rna từ bệnh phẩm bằng bộ kit tách dna tổng số hoặc rna tổng số

Chạy phản ứng rt-pcr dùng mồi ngẫu nhiên với virus có bộ gen là rna (bỏ qua bước này nếu kít sử dụng real-time pcr có chứa luôn phản ứng rt-pcr)

Bật máy PCR 15 phút trước khi chạy phản ứng RT-PCR

Thực hiện bước này với các tube RT-PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

Chỉ lấy đủ số tube RT-PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng RTPCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.

Cho dịch RNA tách chiết vào từng tube RT-PCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy PCR.

Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy PCR hoạt động theo hướng dẫn của bộ kit RT-PCR. 

Cho máy PCR chạy chương trình.

Chạy phản ứng real-time pcr

Bật máy real-time PCR 15 phút trước khi cho máy chạy. Bật máy tính và khởi động chương trình real-time PCR. 

Thực hiện bước mix với các tube PCR mix được giữ trong khay lạnh hoặc đá đang tan.

Chỉ lấy đủ số tube PCR mix cần. Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dước đáy tube.

Cho chứng +, chứng -, các nồng độ standard, dịch DNA vừa tách (hoặc dịch cDNA vừa thu nhận được (hoặc RNA vừa tách được nếu kít Real-time PCR có chứa phản ứng RT-PCR)) vào từng tube Real-time PCR Mix. Xong, đặt các tube vào máy real-time PCR.

Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” trên phần mềm đúng với vị trí mẫu đã đặt trên máy real-time PCR.

Chọn màu cho mẫu, chứng dương, chứng âm, standart theo hướng dẫn của bộ kít sử dụng

Cài đặt chương trình “Protocol” cho máy real-time PCR hoạt động

Lưu file dữ liệu vào máy tính

Cho máy real-time PCR chạy chương trình.

Nhận định kết quả

Nhận định kết quả qua phân tích của máy dựa trên cơ sở hướng dẫn của bộ kít Real-time PCR được sử dụng.

Những sai sót và xử trí

Phản ứng dương tính giả: do tạp nhiễm từ môi trường

Phản ứng âm tính giả: do phản ứng PCR bị ức chế hoặc do máy Realtime PCR bị hỏng.

Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân thủ chặt chẽ quy trình kỹ thuật.